RNA酶與DEPC相克背后的機制

Part.01

RNA酶何方神圣

RNA酶（Ribonuclease，簡稱RNase）是一類能夠催化RNA分子降解的酶，通過水解RNA鏈中的磷酸二酯鍵，將RNA分解成更小的片段或單核苷酸，是RNA實驗過程中的超級克星（而其中最大罪魁禍?zhǔn)资荝NAse A，該酶分子量約13.7 kDa，含4個二硫鍵的單鏈多肽結(jié)構(gòu)）。

它在自然界中無處不在，既是生物體內(nèi)RNA代謝的關(guān)鍵角色，也是分子生物學(xué)實驗中需要嚴(yán)加防范的“頑固分子”。

環(huán)境中RNA酶的污染源主要包括外源性和內(nèi)源性兩大類，外源主要來于人體分泌物（如皮膚、汗液、唾液、淚液）、微生物（細(xì)菌、真菌）、實驗室器皿與耗材（如槍頭、離心管、玻璃器皿、實驗臺面、移液器）、試劑與水；

還有一種是內(nèi)源，待測生物樣本本身也會含有，如各種組織、細(xì)胞均含有大量內(nèi)源性RNase，一般通過后期添加抑制劑方式處理來消除干凈。

它最大的危害在于直接降解RNA，在瓊脂糖凝膠電泳上，你會看到一條清晰的28S和18S rRNA條帶變得模糊、拖尾甚至完全消失，取而代之的是一片彌散條帶。這是RNA已降解的典型標(biāo)志，一個完整的真核細(xì)胞總RNA，28S條帶的亮度應(yīng)約為18S條帶的兩倍。

Part.02

為何如此頑固

RNA酶本身是一種蛋白，但為什么通常的高溫濕熱滅菌（如121°C，20-30分鐘））方法對其滅活收效甚微呢？這還是和它結(jié)構(gòu)本身有著密切的聯(lián)系。

高溫高壓確實能使RNase A的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)展開（變性），使其暫時失活，然而，當(dāng)溫度和壓力下降，溶液冷卻時，RNase A分子能夠重新折疊回其天然的、具有完全催化活性的正確構(gòu)象。

這種“自動復(fù)原”的能力，歸功于其一級結(jié)構(gòu)中4個二硫鍵的“錨定”作用，以及其氨基酸序列本身固有的強烈折疊傾向。這些二硫鍵就像一張圖紙，指引著變性的蛋白質(zhì)鏈準(zhǔn)確地恢復(fù)原樣。

Part.03

DEPC作用原理

我們當(dāng)前采取的主流方式是DEPC（焦碳酸二乙酯），它是通過抑制活性來達(dá)到目的。在常溫下，DEPC是一種無色、粘稠的液體，本身不太穩(wěn)定，在高溫下容易分解為二氧化碳和乙醇。另外，DEPC能夠與蛋白質(zhì)中的多種親核基團（如氨基、巰基、酚基等）發(fā)生反應(yīng)，從而共價修飾這些蛋白質(zhì)。

（DEPC分子結(jié)構(gòu)）

RNAse A的催化活性依賴于其活性中心特定的氨基酸殘基（特別是第12和119位的組氨酸，DEPC分子中的乙基基團會特異性地、共價地連接到組氨酸殘基的咪唑環(huán)的氮原子上，這個修飾過程是不可逆的。

雖說效果驚人，但本身有致癌風(fēng)險，同時對實驗也存在不少隱患。一方面DEPC不僅能修飾蛋白質(zhì)，也能與任何含有-NH，-SH或-OH等基團發(fā)生反應(yīng)。比如常用的Tris，本身就是一個伯胺，DEPC會迅速與Tris反應(yīng)，使其失效，并生成無活性的副產(chǎn)物，所以配置此類試劑不能使用DEPC相關(guān)溶液。

這里要尤其要注意的是，DEPC溶液和DEPC處理水是兩碼事，前者是配置的溶液，化學(xué)性質(zhì)活潑，具有反應(yīng)能力；市面上的DEPC處理水是指用DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的超純水，當(dāng)經(jīng)過混勻以及高溫滅菌后，DEPC會降解成二氧化碳和酒精，失去毒性。

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