如何讓感受態(tài)細(xì)胞延年益壽

在世界各地的實驗室中，將細(xì)菌甘油菌種保存在-80°C是一種常見的做法，這種方法能夠長期保存細(xì)菌菌株。對于依賴這些菌種來保證實驗一致性和可重復(fù)性的研究人員來說，這些菌種在保持活性的前提下能夠保存多久至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)菌在-80 ℃的甘油溶液中保存時，甘油起到冷凍保護(hù)劑的作用。這可以防止冰晶的形成，從而避免對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損害，進(jìn)而延長細(xì)菌培養(yǎng)物的壽命并提高其活性。通常使用15-25%的甘油濃度，使細(xì)菌細(xì)胞保持休眠狀態(tài)，以便在需要時被激活。很多人以為“凍上就行”，把感受態(tài)細(xì)胞隨手塞進(jìn)-20℃冰箱其實是大錯特錯。研究發(fā)現(xiàn)，在-20℃下，感受態(tài)細(xì)胞幾天之內(nèi)就能丟掉90%以上的轉(zhuǎn)化效率！為什么？因為-20℃雖然看著也結(jié)冰了，但分子運動還沒慢到足夠保護(hù)細(xì)胞膜的地步。

NEB方面的實驗表明大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（NEB #C2987H）在-20°C下儲存24小時后，失去94.5%的轉(zhuǎn)化效率。 2天后失去98.9%的轉(zhuǎn)化效率，儲存一周，減少99.6%轉(zhuǎn)化效率。Koenig GL等進(jìn)行了一項時間跨度達(dá)10年的研究，結(jié)果顯示重組E.coli 在-20 ℃保存10個月后，質(zhì)粒保留率下降20-40%（無抗生素選擇時更高），復(fù)蘇后菌落中無質(zhì)粒比例達(dá)15%。追蹤10年細(xì)胞庫顯示-80 ℃下10年質(zhì)粒保留率>95%，而-20 ℃下早期質(zhì)粒就發(fā)生顯著丟失。

主流商用感受態(tài)細(xì)胞的產(chǎn)品說明書都寫得清清楚楚，在-80℃左右儲存、避免反復(fù)凍融，部分產(chǎn)品未明確說明保存期限，但是寫了解凍后應(yīng)立即使用，長時間放置會降低轉(zhuǎn)化效率。細(xì)胞這轉(zhuǎn)化效率為10?–10? cfu/μg甚至更高。部分產(chǎn)品明確說明6個月保質(zhì)期，超過這個期限，廠家不再保證轉(zhuǎn)化效率，但細(xì)胞并不會立刻死亡，只是轉(zhuǎn)化效率會緩慢下降。

每次從-80℃拿出來化凍，再放回去，就等于給細(xì)胞來了一次“折磨”。數(shù)據(jù)顯示，每經(jīng)歷一次完整的凍融循環(huán)，轉(zhuǎn)化效率差不多掉一半！兩三次下來，你的“高效率感受態(tài)”可能就變成“勉強能用”了。 所以最明智做法是一開始就分裝成單次使用的小管（比如100 μL/管），用的時候一次性拿幾管出來，用不完的直接丟棄。

常規(guī)單質(zhì)?？寺　⑺{(lán)白斑篩選、點突變驗證、BL21蛋白表達(dá)，這些只要長出幾個到幾十個菌落就成功，老細(xì)胞完全可以上，也夠用。但構(gòu)建文庫、多片段拼接、轉(zhuǎn)化大片段或低拷貝質(zhì)粒時，轉(zhuǎn)化效率直接決定多樣性或成功率，這時候超過一年的細(xì)胞最好別冒險。

轉(zhuǎn)化效率（Transformation Efficiency）的單位是：cfu/μg（每微克DNA得到的菌落形成單位）。這是衡量感受態(tài)細(xì)胞好壞的黃金標(biāo)準(zhǔn)。下面以最常見的DH5α轉(zhuǎn)化實驗為例，手把手教你怎么算。

轉(zhuǎn)化效率（cfu/μg）=(長出來的菌落數(shù)) ÷ (實際使用的質(zhì)粒DNA量，μg)

計算步驟

1.取50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞（冰上化凍）；

第一，全程-80℃保存，不進(jìn)-20℃；第二，制備后立即單次分裝；第三，放在冰箱內(nèi)部穩(wěn)定區(qū)域，避免開門溫度波動；第四，貼好制備日期，用多少拿多少；第五，解凍即用，不在冰上長時間放置。