QPCR實(shí)驗(yàn)

Part.01

染料法原理巧妙之處

在染料法中，經(jīng)典染料如Sybr Green，會(huì)與DNA雙鏈中的小溝非特異結(jié)合，隨著擴(kuò)增量增多，其熒光強(qiáng)度會(huì)等比例加劇。

問題來了，整個(gè)過程中，雖然雙鏈DNA數(shù)量以指數(shù)級增長，可熒光染料并沒有增加，但熒光強(qiáng)度為什么會(huì)升高呢？我們可能知道，其關(guān)鍵在于游離的染料幾乎只能發(fā)出微弱的熒光，只有結(jié)合小溝時(shí)，它們熒光強(qiáng)度會(huì)瞬間增強(qiáng)成百上千倍，這又是什么原因。

當(dāng)SYBR Green I 染料在溶液中自由漂浮時(shí)，它的化學(xué)鍵可以自由旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)，整個(gè)分子也在不停地布朗運(yùn)動(dòng)。它吸收一個(gè)光子能量后，會(huì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這個(gè)激發(fā)態(tài)的能量需要以某種方式釋放出來，分子才能回到基態(tài)。

在游離狀態(tài)下，激發(fā)態(tài)能量很容易通過分子自身的旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)（即分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)）轉(zhuǎn)化為熱能并耗散掉，這個(gè)過程被稱為 “非輻射衰變”。因?yàn)槟芰恐饕ㄟ^非輻射衰變（發(fā)熱）消耗了，所以通過發(fā)射光子（即熒光）這種“輻射衰變”途徑釋放的能量就非常少，熒光信號極其微弱。

當(dāng)SYBR Green I 染料插入到雙鏈DNA的小溝中時(shí)，它被緊緊地固定在了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)里，就像三明治的夾心一樣，這種結(jié)合極大地限制了染料分子的自由旋轉(zhuǎn)和振動(dòng)。此時(shí)，當(dāng)染料吸收光子能量變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)后，由于分子運(yùn)動(dòng)被嚴(yán)重限制，“非輻射衰變”這個(gè)能量釋放通道就被大大削弱了，甚至幾乎被關(guān)閉了，最后只能以更高的 “輻射衰變”途徑釋放，即發(fā)射出一個(gè)熒光光子，因此，我們檢測到的熒光信號就變得非常強(qiáng)。

（蓉為基因）

那么，QPCR染料換成其他染料是否能行，如熒光素（FITC）、羅丹明（TRITC）、Cy系列染料？答案是不能，這些染料在游離時(shí)（本身很亮）與結(jié)合后熒光強(qiáng)度不會(huì)產(chǎn)生多大的變化，所以結(jié)合后熒光強(qiáng)度驟變才是巧妙之處。

Part.02

Ct值范圍多少算合理

Ct是 Cycle Threshold Value的縮寫，中文叫循環(huán)閾值或閾值循環(huán)數(shù)，指qPCR反應(yīng)中，體系的熒光信號強(qiáng)度首次達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，其數(shù)值大小與起始模板有直接關(guān)系（對數(shù)關(guān)系）。

從常規(guī)實(shí)驗(yàn)來說，一個(gè)運(yùn)行良好的qPCR實(shí)驗(yàn)，其Ct值通常落在10到35之間，處女座老師更喜歡15-25之間，堪稱完美。

若低于10，意味著模板量極高，可能是加樣錯(cuò)誤；若在30-35或者更高，那就是板量非常低，此時(shí)需要特別小心，因?yàn)橹貜?fù)樣品之間的變異可能會(huì)增大，對于絕對定量，此范圍的定量準(zhǔn)確性會(huì)下降。

有人會(huì)問，為什么這個(gè)數(shù)值范圍是合理的，是什么原因？

當(dāng)Ct值為35時(shí)，根據(jù)PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2^n）反推，起始模板量可能遠(yuǎn)低于1個(gè)拷貝（例如，0.1個(gè)拷貝）。這意味著在反應(yīng)體系中，模板DNA分子是“屈指可數(shù)”的，如此少量的模板分子在分配到不同的反應(yīng)孔中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致有些孔有模板，而有些卻沒有，于是重復(fù)性面臨巨大挑戰(zhàn)。

那么能不能更低的循環(huán)，也不行，因?yàn)橥ǔＰ枰蠹s10-15個(gè)循環(huán)，信噪比才能達(dá)到穩(wěn)定檢測的要求。

Part.03

Tm值有什么講究

實(shí)驗(yàn)老法師都知道，QPCR不做溶解曲線，Ct值那將毫無意義可言，這該如何理解。

1、非特異擴(kuò)增

染料法熒光PCR有個(gè)非常嚴(yán)重的Bug，染料會(huì)無差別的結(jié)合任何雙鏈DNA小溝，如非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，或引物二聚體等。正好，熔解曲線可以能解決這個(gè)問題，它通過逐步升溫，將產(chǎn)物重新熔解，結(jié)合熒光又變回了游離狀態(tài)，于是會(huì)形成一個(gè)熒光衰減曲線，單一峰象征著沒被污染。

2、Tm值含義

Tm值含義為50%的雙鏈DNA解鏈變成單鏈DNA時(shí)的溫度，該值大小與DNA分子長度、堿基構(gòu)成和離子強(qiáng)度有關(guān)，那么這里為什么會(huì)取50%作為評測點(diǎn)呢？

DNA的雙鏈解鏈（變性）不是一個(gè)“全或無”的瞬間過程，而是一個(gè)隨著溫度升高而逐漸發(fā)生的協(xié)同過程。您可以把它想象成冰融化成水，有一個(gè)從固態(tài)到液態(tài)的過渡區(qū)間。50%解鏈這個(gè)點(diǎn)恰好是整個(gè)相變過程的中點(diǎn)，在數(shù)學(xué)上是S形曲線的拐點(diǎn)，代表了從雙鏈主導(dǎo)到單鏈主導(dǎo)的臨界狀態(tài)。

在50%解鏈點(diǎn)時(shí)，系統(tǒng)的變化最為敏感和劇烈。這一點(diǎn)附近的熒光變化速率是最快的（在熔解曲線的負(fù)導(dǎo)數(shù)圖上表現(xiàn)為峰值）。選擇變化率最大的點(diǎn)作為特征溫度，其受微小干擾（如溫度校準(zhǔn)誤差、背景熒光波動(dòng)）的影響最小，因此測量結(jié)果最精確、最穩(wěn)定、可重復(fù)性最高。

舉個(gè)例子，我們定義水的沸點(diǎn)是100°C（在1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下），此時(shí)水正在劇烈汽化，而不是定義水剛開始產(chǎn)生第一個(gè)氣泡的溫度（比如95°C）或完全蒸干的溫度。中點(diǎn)是最具代表性、最容易客觀判定的。

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