【微生物學(xué)報(bào)】代爾夫特菌PG-8降解青霉素G的特性及分子機(jī)制

發(fā)布日期：2025-12-19 15:16:19

【微生物學(xué)報(bào)】代爾夫特菌PG-8降解青霉素G的特性及分子機(jī)制

摘要

目的篩選青霉素G (penicillin G, PENG)降解菌，并解析其分解代謝的關(guān)鍵酶，為青霉素菌渣的生物處理提供菌種和基因資源。

方法以青霉素G鉀(penicillin G potassium, PGK)為底物，通過(guò)富集培養(yǎng)篩選能夠利用其為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株；結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)鑒定分解代謝的關(guān)鍵酶并分析其進(jìn)化起源；表達(dá)并純化關(guān)鍵酶，解析其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)；通過(guò)基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)揭示關(guān)鍵基因在細(xì)菌利用PGK生長(zhǎng)過(guò)程中的生理功能。

結(jié)果獲得的代爾夫特菌屬(Delftia sp.) PG-8能夠降解并利用PGK作為唯一碳源生長(zhǎng)，且在pH 7.0、溫度35 ℃、底物濃度為10.00 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出最佳的底物降解效果和細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。PgkA能夠催化PGK快速降解[Km=(99.19±19.45) μmol/L，kcat/Km=(1.96±0.55)×105 L/(mol·s)]，并且與已完成功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶相比PgkA具有獨(dú)特的進(jìn)化起源。PgkB也能夠催化PGK降解，但其對(duì)底物的親和力僅為PgkA的1/5，且底物催化效率也較低。菌株P(guān)G-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkB降解和利用PGK生長(zhǎng)的能力均顯著下降，且PG-8-ΔpgkA能力下降更為明顯。雖然同時(shí)敲除pgkA和pgkB的PG-8-ΔpgkAB仍能降解一定量的底物，但無(wú)法利用PGK作為唯一碳源生長(zhǎng)。

結(jié)論P(yáng)G-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠利用PGK作為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，pgkA和pgkB在PG-8利用PGK作為唯一碳源生長(zhǎng)過(guò)程中均具有重要的生理功能，但pgkA起主導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞青霉素G降解；代爾夫特菌；篩選鑒定；酶學(xué)分析；降解機(jī)理

青霉素的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑是20世紀(jì)公共衛(wèi)生領(lǐng)域最偉大的成就之一。隨后，人類進(jìn)入了抗生素發(fā)展和利用的黃金時(shí)期，各類抗生素在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和生物科學(xué)研究領(lǐng)域均作出了巨大貢獻(xiàn)[1]。在給人類社會(huì)帶來(lái)空前藥物繁榮的同時(shí)抗生素在環(huán)境中的持續(xù)積累也引發(fā)了耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和耐藥基因的傳播，給生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重危害[2-4]。調(diào)查顯示，全球34個(gè)國(guó)家的287條主要河流均受到不同程度的抗生素污染，其中覆蓋我國(guó)58個(gè)河流流域的污染情況較為嚴(yán)重[5]。雖然抗生素耐藥性是一種由來(lái)已久且在環(huán)境中普遍存在的現(xiàn)象[6]，但環(huán)境中抗生素的持續(xù)積累會(huì)加速耐藥細(xì)菌的進(jìn)化和耐藥基因的傳播，進(jìn)而導(dǎo)致全球出現(xiàn)嚴(yán)重的抗生素抗性危機(jī)[7-8]。

在種類繁多的抗生素中β-內(nèi)酰胺類抗生素的生產(chǎn)和應(yīng)用最為廣泛，占全球抗生素市場(chǎng)份額的65%左右[9]。中國(guó)作為全球最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)[10]，青霉素年產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的75%，其中2020年青霉素G (penicillin G, PENG)的全球消耗量占比高達(dá)32.02%[11]。研究顯示青霉素G在全球沉積物中的最高濃度達(dá)974 μg/kg[12]，已成為嚴(yán)重的環(huán)境污染物，該抗生素也被認(rèn)為是導(dǎo)致全球性抗生素耐藥性的重要因素之一。據(jù)估計(jì)，每生產(chǎn)1 t抗生素會(huì)產(chǎn)生約8-10 t抗生素濕菌渣[13-14]。以青霉菌發(fā)酵為例，我國(guó)青霉素年產(chǎn)量約為1.5萬(wàn)t，其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生15萬(wàn)t青霉素菌渣[15]?？股鼐袣埩艨股丶氨姸嘤卸敬x產(chǎn)物，例如青霉素菌渣中青霉素含量高達(dá)0.90-1.10 g/kg[16]，因此青霉素菌渣的處理對(duì)抗生素生產(chǎn)企業(yè)而言是一個(gè)巨大的負(fù)擔(dān)。此外，菌渣中的殘留青霉素進(jìn)入土壤和水體后不僅會(huì)通過(guò)食物鏈危害人體和其他動(dòng)植物健康[17-19]，還會(huì)影響微生物群落，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥菌出現(xiàn)[20-22]。

對(duì)于抗生素菌渣的處置常規(guī)的吸附、膜分離、熱化學(xué)處理技術(shù)費(fèi)用極其高昂[23-26]，因此經(jīng)濟(jì)有效的無(wú)害化處置策略亟待探索。微生物具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，面對(duì)種類繁多的抗生素污染，細(xì)菌能通過(guò)進(jìn)化出相應(yīng)的分解代謝系統(tǒng)獲得生存能力。自2008年Dantas等報(bào)道了降解PENG的純培養(yǎng)微生物(未鑒定種屬)后[27]，該抗生素降解菌被陸續(xù)分離鑒定，包括副球菌屬(Paracoccus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、螯合球菌屬(Chelatococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)等，而且一些降解菌分解代謝PENG的代謝途徑也有少許報(bào)道。Paracoccus sp. KDSPL-02降解PENG時(shí)首先通過(guò)β-內(nèi)酰胺環(huán)水解生成青霉噻唑酸，然后水解生成苯乙酸和類似于6-氨基青霉烷酸的中間產(chǎn)物，隨后進(jìn)入下游未知代謝途徑實(shí)現(xiàn)PENG降解，但該途徑相關(guān)的基因和酶尚未鑒定[28]。Crofts等[29]研究4株土壤微生物通過(guò)共享策略降解PENG時(shí)，推測(cè)這些微生物也是通過(guò)該途徑完成PENG降解，并鑒定了水解青霉噻唑酸酰胺鍵生成苯乙酸的酰胺酶。最近，Zhang等[30]在研究Sphingobacterium sp. SQW1時(shí)利用細(xì)胞和粗酶液生物轉(zhuǎn)化PENG檢測(cè)到多個(gè)疑似的中間產(chǎn)物，推測(cè)該菌株降解PENG可能存在3條代謝途徑。SQW1菌株和粗酶液降解PENG均以β-內(nèi)酰胺酶起始降解，然后通過(guò)2條不同的下游代謝途徑實(shí)現(xiàn)PENG的完全礦化；通過(guò)中間代謝產(chǎn)物推測(cè)該菌株降解PENG還可能存在第3條途徑，即由?；D(zhuǎn)移酶起始PENG降解生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸[30]。然而，該菌株中復(fù)雜的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)均是基于代謝產(chǎn)物的推測(cè)，缺乏直接的基因和酶學(xué)研究。

目前報(bào)道的青霉素降解菌中能夠以PENG為唯一碳源生長(zhǎng)的純培養(yǎng)菌株較少。多數(shù)研究?jī)H止步于降解功能的鑒定，缺乏對(duì)PENG降解關(guān)鍵酶和基因的研究。本研究從青霉素菌渣中篩選到代爾夫特菌屬中第一株能夠降解PENG并利用其為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌PG-8 (保藏號(hào)：CCTCC M 2024394)；進(jìn)一步研究了PG-8降解PENG的特性，并對(duì)參與PENG代謝的關(guān)鍵基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)純化和酶學(xué)分析，同時(shí)驗(yàn)證了關(guān)鍵基因的生理功能。本研究從分子、生化和遺傳學(xué)層面系統(tǒng)闡釋了細(xì)菌降解PENG的分子機(jī)制，在抗生素菌渣微生物處理方面具有重要的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.00，酵母提取物5.00，NaCl 5.00，121 ℃滅菌20 min。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(minimal medium, MM) (g/L)：K2HPO4 0.76，KH2PO4 0.19，(NH4)2SO4 1.00，MgSO4 1.00，微量元素體積分?jǐn)?shù)為1.00%，按需調(diào)節(jié)不同的pH，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，其質(zhì)量體積比為1.50%。

1.2 引物、質(zhì)粒、菌株與培養(yǎng)條件

本研究所用引物見(jiàn)表1，菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表2。Delftia sp. PG-8及其突變株在LB或添加不同濃度青霉素G鉀(penicillin G potassium, PGK)的MM中培養(yǎng)。大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)。抗生素添加終濃度：卡那霉素為50.00 μg/mL，氨芐青霉素為100.00 μg/mL，氯霉素為34.00 μg/mL，四環(huán)素為20.00 μg/mL。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

表2 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.3 菌株的篩選和鑒定

取1.00 g青霉素菌渣放入裝有100.00 mL MM的錐形瓶中，加入5.00 mmol/L PGK后，于150 r/min搖床中培養(yǎng)5 d。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，重復(fù)此操作3次。取培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋，并均勻涂布在以PGK (5.00 mmol/L)為唯一碳源的MM平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落進(jìn)一步劃線純化。獲得的純培養(yǎng)細(xì)菌分別進(jìn)行革蘭氏染色、掃描電鏡觀察和16S rRNA基因序列分析。

菌株P(guān)G-8在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6，25 ℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體，并用MM洗滌3次后懸浮，然后轉(zhuǎn)接至含有5.00 mmol/L PGK的MM中，使初始OD600約為0.1。接著在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d，定時(shí)取樣并測(cè)定OD600和底物濃度。為優(yōu)化菌株P(guān)G-8降解PGK的最佳條件，分別分析不同pH (5.0-9.0)、溫度(20-40 ℃)、初始底物濃度(1.00-40.00 mmol/L)對(duì)菌株P(guān)G-8降解底物的影響。每組設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，并以只含有PGK的樣品作為對(duì)照。

1.4 生物轉(zhuǎn)化分析

菌株P(guān)G-8在含有2.00 mmol/L葡萄糖的MM中培養(yǎng)至OD600為0.3，加入1.00 mmol/L PGK誘導(dǎo)3 h，以未加入底物的樣品為對(duì)照，設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。離心收集菌體(8 000×g, 5 min)，用20.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗2次后懸浮，使OD600為2.0。加入2.00 mmol/L底物后定時(shí)取樣(0.50 mL)，并加入等體積的甲醇劇烈振蕩5 min裂解細(xì)胞。然后高速離心(15 000×g, 30 min)，取上清進(jìn)行HPLC分析。通過(guò)LC-MS進(jìn)行中間代謝產(chǎn)物的鑒定。

1.5 基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)定

提取菌株P(guān)G-8基因組DNA，并在北京諾禾致源科技股份有限公司完成基因組測(cè)序。菌株P(guān)G-8在含有2.00 mmol/L葡萄糖的MM中培養(yǎng)至OD600為0.3，加入1.00 mmol/L的PGK或葡萄糖(對(duì)照)誘導(dǎo)3 h后收集菌體，經(jīng)液氮速凍后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.6 蛋白表達(dá)與純化

采用表1中的引物分別擴(kuò)增pgkA和pgkB基因，使用In-Fusion? HD Cloning Kit [寶生物工程(大連)有限公司]將目的片段與經(jīng)過(guò)EcoR I和Xba I雙酶切的pBAD18載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli TOP10。將表達(dá)菌株接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度0.10%的l-阿拉伯糖16 ℃、120 r/min誘導(dǎo)8 h，之后4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，用預(yù)冷的50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗2次后重懸，在冰水浴中超聲破碎(破碎5 s，停7 s) 20 min。細(xì)胞裂解液在4 ℃、20 000×g離心45 min后，上清液加入含有Ni2+-NTA樹(shù)脂的層析柱，并用50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗色譜柱，除去未結(jié)合的蛋白和雜質(zhì)。依次用含有不同濃度咪唑(40.00、80.00、120.00、250.00 mmol/L)的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫。樣品經(jīng)SDS-PAGE分析后，選擇目的蛋白較為單一的樣品透析過(guò)夜。透析后的蛋白用Ultra-15超濾管(截留分子量10 kDa，Merck Millipore公司)濃縮后用于酶活性分析。

1.7 酶學(xué)分析和產(chǎn)物鑒定

5.00 mL PgkA酶活性反應(yīng)體系包括50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、14.60 μg PgkA (不添加PgkA為對(duì)照)，加入0.10 mmol/L底物，在30 ℃啟動(dòng)反應(yīng)。PgkA酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)體系：在5 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.5)中加入5.90 μg PgkA，隨后加入不同濃度的底物(15.00-285.00 μmol/L)啟動(dòng)反應(yīng)，30 s取樣1次，并立即加入等體積甲醇終止反應(yīng)，25 ℃、12 000 r/min離心10 min后通過(guò)HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

5.00 mL PgkB酶活性反應(yīng)體系包括50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、40.40 μg PgkB (不添加PgkB為對(duì)照)，加入0.50 mmol/L底物，在30 ℃啟動(dòng)反應(yīng)。PgkB酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)體系：在5.00 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.5)中加入40.40 μg PgkB，隨后加入底物(0.10-1.00 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng)，每2 min取1次樣，隨后立即加入等體積的甲醇終止反應(yīng)，25 ℃、12 000 r/min離心10 min后進(jìn)行HPLC分析。

1.8 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)分析

HPLC分析采用的色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動(dòng)相組成：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)為0.10%的磷酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫程序：0-20 min，33% B線性增加至90% B，并保持20 min；然后在 0.1 min內(nèi)重新回到33% B，持續(xù)保持4.9 min后結(jié)束。流速為1.00 mL/min，柱溫保持在30 ℃，進(jìn)樣量為10.00 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

LC-MS分析采用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)進(jìn)行分析，柱溫維持在30 ℃。流動(dòng)相由體積分?jǐn)?shù)為0.10%的磷酸水溶液(A相)和甲醇(B相)組成，流速1.00 mL/min。采用梯度洗脫程序：0-20 min內(nèi)A相從67%線性降至10%，20-25 min恢復(fù)至67% A相。進(jìn)樣體積為10.00 μL。樣品經(jīng)UPLC流出后，在正離子模式下通過(guò)電噴霧電離(ESI)進(jìn)入質(zhì)譜儀。ESI-MS條件設(shè)置：毛細(xì)管電壓3.00 kV，源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，氮?dú)?純度99.90%)作為脫溶劑氣，流速800 L/h。

1.9 pgkA和pgkB的基因敲除和回補(bǔ)

基因敲除實(shí)驗(yàn)采用In-Fusion? HD Cloning Kit將目的基因的上游和下游約1 kb的片段以及氯霉素抗性基因連接到EcoR I和Hind III酶切的pEX18Tc上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，得到敲除質(zhì)粒(表2)。將敲除載體轉(zhuǎn)化至2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的E. coli WM3064中。含有敲除質(zhì)粒的WM3064在含有0.30 mmol/L 2,6-DAP的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6，然后與PG-8菌株接合，在含2,6-DAP的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過(guò)夜。用LB清洗混合菌體2次，稀釋涂布至含34.00 μg/mL氯霉素和質(zhì)量體積比為10%的蔗糖的LB培養(yǎng)基平板上，挑取具有抗性的菌落，并利用PCR和測(cè)序鑒定突變株。

基因互補(bǔ)采用廣宿主質(zhì)粒pRK415實(shí)現(xiàn)。將pgkA和pgkB基因分別連接到EcoR I和Xba I酶切的pRK415上構(gòu)建互補(bǔ)質(zhì)粒(表2)，電轉(zhuǎn)化至PG-8突變株中，利用測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性克隆。

1.10 菌株和基因序列編號(hào)

菌株P(guān)G-8保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC M 2024394。菌株P(guān)G-8的16S rRNA基因、pgkA、pgkB序列已在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)，序列號(hào)分別為PP077309、PV522064和PV522065。

2 結(jié)果與分析

2.1 Delftiasp. PG-8的篩選和鑒定

通過(guò)富集培養(yǎng)，從青霉素菌渣中篩選出一株能降解PGK的菌株。革蘭氏染色顯示該菌株為革蘭氏陰性細(xì)菌，掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)為桿狀(圖1A)?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，該細(xì)菌屬于代爾夫特菌(Delftia) (圖1B)，將其命名為PG-8，并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(編號(hào)為CCTCC M 2024394)。將菌株P(guān)G-8接種于以PGK為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，底物被快速降解；生物量(OD600)在接種后的12 h內(nèi)下降明顯，推測(cè)這是由于底物及其代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌具有毒性效應(yīng)。然而，隨著底物的進(jìn)一步降解和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌生物量明顯增加，這充分說(shuō)明PG-8能利用PGK作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)(圖1C)。本研究發(fā)現(xiàn)，PG-8是代爾夫特菌屬細(xì)菌中第一株能夠降解PGK并利用其為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌。

圖1 菌株P(guān)G-8的篩選和鑒定。A：菌株P(guān)G-8的掃描電鏡；B：菌株P(guān)G-8基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[括號(hào)中的序號(hào)為細(xì)菌的基因組序列號(hào)，分支點(diǎn)上的數(shù)字為支持值，代表該分支的可信程度(值越高，可信程度越高)，標(biāo)尺表示遺傳距離]；C：菌株P(guān)G-8利用PGK為唯一碳源生長(zhǎng)。Figure 1 Screening and identification of strain PG-8. A: Scanning electron microscope image of strain PG-8; B: Phylogenetic tree of strain PG-8 based on 16S rRNA gene sequence [The serial numbers in parentheses are the genomic serial numbers of the bacteria; The numbers on the branch points are support values representing the credibility of the branch (the higher the value, the higher the credibility), and the scale indicates the genetic distance]; C: Growth of strain PG-8 using penicillin G as the sole carbon source.

2.2 PG-8對(duì)PGK的降解特性研究

考慮到PG-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠降解PGK并利用其為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，且該屬細(xì)菌降解PGK的現(xiàn)有數(shù)據(jù)較少。因此，本研究進(jìn)一步分析了不同pH、溫度、底物濃度對(duì)菌株P(guān)G-8降解PGK的影響，并優(yōu)化了底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的最適條件，為后續(xù)生物修復(fù)提供數(shù)據(jù)支撐。

2.2.1 不同pH對(duì)底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

當(dāng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH在5.0-9.0范圍時(shí)菌株P(guān)G-8均能快速降解PGK，但pH在7.0、8.0、9.0時(shí)的降解速率明顯高于pH 5.0和6.0時(shí)的降解速率(圖2A)。當(dāng)pH為8.0時(shí)菌株P(guān)G-8降解PGK的速率最快，12 h內(nèi)能完全降解初始濃度為5.00 mmol/L的PGK。當(dāng)pH為5.0時(shí)底物自發(fā)降解比較明顯，說(shuō)明PGK在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生自發(fā)水解。與底物降解不同，菌株P(guān)G-8在pH 5.0和6.0條件下的生長(zhǎng)情況優(yōu)于pH 7.0、8.0、9.0條件下的生長(zhǎng)情況(圖2B)，該現(xiàn)象與Zhang等[30]的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能是酸性條件下PGK的自發(fā)降解會(huì)減弱抗生素對(duì)細(xì)菌的毒性，從而有利于細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，綜合考慮細(xì)菌生長(zhǎng)情況和底物自降解干擾，后續(xù)在pH 7.0進(jìn)行底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)研究。

圖2 不同pH對(duì)底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。A：不同pH對(duì)菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同pH對(duì)菌株P(guān)G-8生長(zhǎng)的影響。Figure 2 Effects of different pH on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different pH on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different pH on the growth of strain PG-8.

2.2.2 不同溫度對(duì)菌株P(guān)G-8降解PGK的影響結(jié)果

在pH 7.0條件下設(shè)置不同溫度(20、25、30、35、40 ℃)，研究菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長(zhǎng)過(guò)程中的底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度在20-35 ℃時(shí)隨著溫度升高菌株P(guān)G-8降解PGK的速率逐漸加快；當(dāng)溫度進(jìn)一步提升至40 ℃時(shí)降解速率減緩(圖3A)。在溫度為35 ℃時(shí)菌株P(guān)G-8在18 h內(nèi)能完全降解5.00 mmol/L的PGK。在細(xì)菌生長(zhǎng)方面，菌株在30 ℃和35 ℃時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較好，且在35 ℃時(shí)生長(zhǎng)速率最快(圖3B)。因此，菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長(zhǎng)的最適溫度為35 ℃。

圖3 不同溫度對(duì)底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。A：不同溫度對(duì)菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同溫度對(duì)菌株P(guān)G-8生長(zhǎng)的影響。Figure 3 Effects of different temperatures on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different temperatures on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different temperatures on the growth of strain PG-8.

2.2.3 不同PGK初始濃度對(duì)底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

在培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)基pH 7.0條件下，設(shè)置不同底物濃度(1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 mmol/L)，研究菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長(zhǎng)過(guò)程中的底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，在上述條件下菌株P(guān)G-8在24 h內(nèi)能完全降解20.00 mmol/L的PGK；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?0.00 mmol/L時(shí)48 h內(nèi)能降解95.20%的底物，隨后底物濃度不再發(fā)生變化(圖4A)。細(xì)菌生長(zhǎng)結(jié)果顯示，細(xì)菌OD600在12 h內(nèi)先下降隨后逐漸上升，而且在36 h后細(xì)菌開(kāi)始快速生長(zhǎng)(圖4B)。這些結(jié)果表明，初始底物濃度對(duì)PGK的降解和菌株P(guān)G-8的生長(zhǎng)有顯著影響，且底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)并非同步，推測(cè)菌株P(guān)G-8是利用PGK的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步作為碳源生長(zhǎng)。

圖4 不同PGK初始濃度對(duì)底物降解和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。A：不同底物濃度對(duì)菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同底物濃度對(duì)菌株P(guān)G-8生長(zhǎng)的影響。Figure 4 Effects of different initial concentrations of penicillin G on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different substrate concentrations on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different substrate concentrations on the growth of strain PG-8.

2.3 生物轉(zhuǎn)化和中間代謝產(chǎn)物的鑒定

為研究菌株P(guān)G-8中參與PGK降解的酶是否為誘導(dǎo)型，本研究進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)PGK誘導(dǎo)的PG-8 (OD600=2.0)能快速降解底物(圖5A)，隨著底物濃度的降低生物轉(zhuǎn)化速率逐漸減緩，最后2.00 mmol/L的PGK能在30 min內(nèi)被完全降解。在此期間，未經(jīng)誘導(dǎo)的PG-8細(xì)胞未檢測(cè)到PGK的明顯降解，表明菌株P(guān)G-8中負(fù)責(zé)起始PGK降解的酶是受底物誘導(dǎo)的。

圖5 PG-8生物轉(zhuǎn)化PGK及中間代謝產(chǎn)物的鑒定。A：底物誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)菌株對(duì)PGK的降解；B：HPLC檢測(cè)中間代謝產(chǎn)物；C-F：中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。Figure 5 Biotransformation of PGK by strain PG-8 and the identification of intermediate metabolites. A: Degradation of PGK by induced and non-induced strains; B: HPLC detection of intermediate metabolites; C-F: Mass spectrometry analysis of intermediate metabolites.

結(jié)合HPLC和LC-MS解析菌株P(guān)G-8分解代謝PGK的中間代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定。PGK被降解過(guò)程中共檢測(cè)到4個(gè)主要的中間代謝產(chǎn)物(圖5B)。根據(jù)LC-MS產(chǎn)物鑒定結(jié)果，本研究推測(cè)青霉素G首先在β-內(nèi)酰胺酶作用下生成青霉噻唑酸(產(chǎn)物1) (圖5C)，隨后脫羧生成(5,5-二甲基-2-{[(2-苯乙酰)氨基]甲基}-1,3-噻唑烯-4-羧酸) (產(chǎn)物2，去羧基青霉素噻唑酸) (圖5D)，產(chǎn)物2再通過(guò)順序脫甲基生成產(chǎn)物3 (圖5E)和產(chǎn)物4 (圖5F)，隨后進(jìn)一步降解進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為菌株P(guān)G-8生長(zhǎng)提供碳源。

2.4 參與PGK降解的基因的鑒定及進(jìn)化分析

生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)起始PGK分解代謝的酶是受底物誘導(dǎo)的，因此本研究結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)探究可能負(fù)責(zé)PGK降解的基因。轉(zhuǎn)錄結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)細(xì)胞相比，PGK誘導(dǎo)的PG-8中編碼一個(gè)class A家族β-內(nèi)酰胺酶的基因(基因組編號(hào)為PG.8_GM002194，NCBI序列號(hào)：PV522064，命名為pgkA)上調(diào)達(dá)196.60倍。在已完成功能鑒定的細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶中，PgkA與皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica) IFM10152的降解青霉素G的FAR-1一致性最高，為47.39%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，這些功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶共分為3個(gè)大的分支，且PgkA獨(dú)立組成一個(gè)分支，暗示菌株P(guān)G-8中起始青霉素G分解代謝的酶可能具有其獨(dú)特的進(jìn)化起源(圖6A)。緊挨pgkA的基因(基因組編號(hào)為PG.8_GM002195，NCBI序列號(hào)：PV522065，命名為pgkB)轉(zhuǎn)錄上調(diào)112.10倍。序列分析顯示，該基因編碼一個(gè)氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。PgkB與NCBI Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中假茄科羅爾斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum) GMI1000的N-乙酰谷氨酸合成酶序列相似性最高，為59.00%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，PgkB與該酶的進(jìn)化關(guān)系最近，并且這2個(gè)酶與其他細(xì)菌屬的N-乙酰谷氨酸合成酶位于完全不同的進(jìn)化分支(圖6B)，暗示它們與其他屬細(xì)菌中的酶具有不同的進(jìn)化起源。

圖6 PgkA和PgkB的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株P(guān)G-8中的pgk基因簇。A：PgkA與其他已驗(yàn)證功能的β-內(nèi)酰胺酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；B：PgkB與其他屬細(xì)菌中氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；C：pgk基因簇。Figure 6 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of PgkA and PgkB their homologous proteins. A: Phylogenetic relationship of PgkA with other functionally validated β-lactamases; B: Phylogenetic relationship of PgkB with the amino acid N-acetyltransferases from other bacterial genera; C: Organization of the pgk gene cluster.

基因組上緊挨pgkAB的PG.8_GM002196和PG.8_GM002198分別編碼一個(gè)TolC家族的外膜孔蛋白(命名為PgkM)和一個(gè)MFS家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(命名為PgkT) (圖6C)。據(jù)報(bào)道，革蘭氏陰性細(xì)菌獨(dú)特的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是親水性抗生素的物理性屏障，外膜孔蛋白可以通過(guò)非特異性滲透作用使這類抗生素穿透細(xì)胞外膜，而細(xì)菌跨內(nèi)膜外泵和攝取抗生素則需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)[29]。因此，本研究推測(cè)PgkM可能是負(fù)責(zé)將青霉素G從細(xì)胞外滲透進(jìn)入周質(zhì)空間的外膜孔蛋白，PgkT則負(fù)責(zé)進(jìn)一步跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后由代謝酶系完成其降解。革蘭氏陰性細(xì)菌跨外膜滲透抗生素已被廣泛報(bào)道，但是利用抗生素為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尚未鑒定，轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也尚不明確。因此，PgkT確切的轉(zhuǎn)運(yùn)功能和機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。pgkA上游的PG.8_GM002193編碼一個(gè)LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PgkR，推測(cè)其可能參與了青霉素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其功能也有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，該菌株基因組中還包含一段完整的苯乙酸代謝基因簇(PG.8_GM006000-PG.8_GM006007)。根據(jù)青霉素G的分子結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)這段基因簇可能也參與了PGK的下游代謝?；蚪M進(jìn)一步分析顯示，pgkAB上下游無(wú)疑似的可轉(zhuǎn)移元件，推測(cè)這2個(gè)基因在細(xì)菌間發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的可能性不大，這也暗示pgkAB不會(huì)因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)移使環(huán)境中的其他細(xì)菌獲得耐藥性。因此推測(cè)，在利用PG-8進(jìn)行青霉素G污染環(huán)境修復(fù)過(guò)程時(shí)其潛在的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)較小。

2.5 PgkA和PgkB的表達(dá)純化和酶活性分析

將pgkA和pgkB基因插入到pBAD18質(zhì)粒上構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，并用0.1%的l-阿拉伯糖誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白的異源表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示，PgkA和PgkB的分子量分別約為30.80 kDa和52.10 kDa (圖7)，與基于它們的氨基酸序列推導(dǎo)的分子質(zhì)量一致。通過(guò)HPLC和LC-MS分析PgkA和PgkB的活性并鑒定其催化反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，PgkA能催化PGK快速降解生成青霉噻唑酸，而且酶的比活為33.90 U/mg。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，PgkA催化PGK降解的Km=(99.19±19.45) μmol/L，kcat=(19.40±1.44) s-1，kcat/Km=(1.96±0.55)×105 L/(mol·s)，米氏常數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線如圖7A所示。對(duì)于PgkB，原本推測(cè)它可能催化PgkA的產(chǎn)物青霉噻唑酸的進(jìn)一步降解。本研究發(fā)現(xiàn)，PgkB并不能催化商業(yè)化的青霉噻唑酸的降解，卻能催化PGK的有效降解生成青霉噻唑酸，催化反應(yīng)時(shí)酶的比活為6.06 U/mg。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，PgkB催化PGK降解的Km=(533.76±90.57) μmol/L，kcat= (6.44±0.51) s-1，kcat/Km=(1.21±0.31)×104 L/(mol·s)，米氏常數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線如圖7B所示。酶學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示，雖然PgkA和PgkB都能催化PGK降解生成青霉噻唑酸，但是PgkA對(duì)PGK的親和力是PgkB的5.4倍，催化效率是PgkB的10倍左右，說(shuō)明PgkA在PG-8降解PGK過(guò)程中起主要作用。

圖7 PgkA (A)和PgkB (B)的純化及其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析Figure 7 Purification and enzyme kinetics analysis of PgkA (A) and PgkB (B).

2.6 基因敲除和回補(bǔ)驗(yàn)證pgkA和pgkB在PG-8降解并利用PGK生長(zhǎng)中的作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證pgkA和pgkB的生理功能，分別構(gòu)建了pgkA和pgkB的缺失突變菌株P(guān)G-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkB，以及同時(shí)敲除pgkAB的突變株P(guān)G-8-ΔpgkAB。與野生型PG-8相比，PG-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkAB降解青霉素G的能力顯著下降，且無(wú)法將青霉素G完全降解，回補(bǔ)菌株的底物降解能力基本恢復(fù)至野生型水平。雖然PG-8-ΔpgkB仍能有效降解青霉素G，但降解速率明顯慢于野生株(圖8A)。在細(xì)菌生長(zhǎng)方面，分別敲除pgkA和pgkB的PG-8仍能利用青霉素G為唯一碳源生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)狀況明顯弱于野生型，且PG-8-ΔpgkA的生長(zhǎng)速率比PG-8-ΔpgkB更慢，同時(shí)敲除pgkA和pgkB的雙敲除菌株P(guān)G-8-ΔpgkAB基本無(wú)法利用青霉素G生長(zhǎng)(圖8B)。因此，結(jié)合酶學(xué)分析和基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)pgkA和pgkB共同起始青霉素G的代謝，但pgkA起主導(dǎo)作用。

圖8 菌株P(guān)G-8及其突變株降解(A)并利用PGK為唯一碳源(B)的生長(zhǎng)情況Figure 8 Degradation by strain PG-8 and its mutants (A) and growth using PGK as the sole carbon source (B).

3 討論

青霉素G (PENG)是一種典型的β-內(nèi)酰胺類抗生素，其在醫(yī)療、畜牧、養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的大量使用對(duì)環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重危害。自從Dantas等報(bào)道了降解PENG的純培養(yǎng)微生物(未鑒定種屬)后[27]，各種降解菌陸續(xù)被分離鑒定。目前能降解PENG的細(xì)菌有11株(表3)，但僅有少數(shù)幾株細(xì)菌能夠利用PENG為唯一碳源生長(zhǎng)。例如，Paracoccus sp. KDSPL-02[28]、Sphingobacterium sp. SQW1[30]、霍氏腸桿菌(E. hormaechei) WM1[32]和肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) Z1[33]在利用PENG生長(zhǎng)過(guò)程中能分別在24、12、9、24 h完全降解800.00-1 200.00、632.92、10.00、300.00 mg/L的底物。Chelatococcus sp. PC-2能在以青霉素G鈉作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且在補(bǔ)充碳氮源的條件下對(duì)400.00 mg/L青霉素鈉的降解率達(dá)98.00%[31]。此外，目前多數(shù)報(bào)道的菌株需要補(bǔ)充額外碳氮源才能有效降解PENG。例如，新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cenocepacia) JZ6幾乎不降解300.00 mg/L的PENG，但補(bǔ)充碳氮源后24 h降解率可達(dá)99.98%[35]。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 3060在添加碳氮源的情況下能夠?qū)?.00 mg/L濃度的PENG徹底降解[36]。還有幾株細(xì)菌在添加額外碳源條件下能降解PENG，但無(wú)法將底物完全降解(表3)。本研究從青霉素菌渣中篩選得到的Delftia sp. PG-8能高效降解青霉素G鉀，并以其為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，且在pH 5.0-9.0、25-40 ℃條件下能完全降解青霉素G鉀，說(shuō)明該菌株具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。此外，PG-8在高濃度底物條件下仍保持較高代謝活性。當(dāng)初始青霉素G鉀濃度為20.00 mmol/L (7 450.00 mg/L)時(shí)，該菌株能完全降解底物并實(shí)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)；即使在底物濃度40.00 mmol/L (14 900.00 mg/L)條件下仍具有95.20%的降解效率。此外，有些代爾夫特菌屬的細(xì)菌被報(bào)道對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素不具備抗藥性[40]，本研究發(fā)現(xiàn)，PG-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠利用PENG為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株。

表3 不同細(xì)菌對(duì)青霉素G的降解情況Table 3 Degradation of PENG by different strains

*: Strains capable of utilizing penicillin G as the sole carbon source; -: The degradation time is unknown.

目前關(guān)于PENG的分解代謝報(bào)道了多條不同的代謝途徑。細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶是絕大多數(shù)抗性細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，因此青霉素噻唑酸被認(rèn)為是PENG降解的主要代謝物之一[41]。菌株P(guān)aracoccus sp. KDSPL-02降解PENG時(shí)首先通過(guò)β-內(nèi)酰胺環(huán)水解生成青霉噻唑酸，然后進(jìn)一步水解生成苯乙酸和類似于6-氨基青霉烷酸的中間產(chǎn)物，隨后進(jìn)入下游未知代謝途徑(圖9中途徑2)[28]。Crofts等[29]研究4株土壤微生物通過(guò)共享策略降解PENG時(shí)，推測(cè)Paracoccus sp. ABC07也是通過(guò)該途徑完成PENG降解。推測(cè)Sphingobacterium sp. SQW1降解PENG時(shí)可能存在3條代謝途徑：菌株SQW1先通過(guò)β-內(nèi)酰胺酶起始PENG的降解生成青霉噻唑酸，然后通過(guò)2條不同的下游代謝途徑實(shí)現(xiàn)PENG的完全礦化(起始反應(yīng)分別類似于途徑3和4)[30]。該菌株降解PENG還可能存在第3條途徑(圖9中途徑5)，即由酰基轉(zhuǎn)移酶起始PENG降解生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸，這2個(gè)產(chǎn)物分別進(jìn)行下游代謝完成PENG的礦化[30]。然而，菌株SQW1降解PENG的復(fù)雜代謝途徑網(wǎng)絡(luò)都只是基于可能的中間代謝產(chǎn)物的鑒定，缺乏必要的基因和酶學(xué)證據(jù)。K. pneumoniae Z1[33]代謝過(guò)程前兩步中間產(chǎn)物與PG-8相同，但第3步中間產(chǎn)物有所不同(圖9中途徑6)，而且該菌株分解代謝青霉素G的基因和酶未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)中間代謝產(chǎn)物鑒定和酶學(xué)分析推測(cè)了PG-8分解代謝PENG的代謝途徑(圖9中途徑1)。PENG首先在PgkA和PgkB作用下裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)生成青霉素噻唑酸，青霉素噻唑酸隨后脫羧轉(zhuǎn)化為去羧基青霉素噻唑酸(產(chǎn)物2)；產(chǎn)物2再經(jīng)過(guò)連續(xù)地去甲基化生成產(chǎn)物3和產(chǎn)物4。中間產(chǎn)物鑒定過(guò)程中還鑒定到了苯乙酸(phenylacetic acid, PAA)的結(jié)構(gòu)類似物1-苯基-2-丙酮，而且在PG-8的基因組中確實(shí)有完整的PAA代謝基因簇，也有研究顯示細(xì)菌在降解PENG過(guò)程中會(huì)形成PAA[29,42]。因此，推測(cè)PG-8降解PENG可能也是通過(guò)下游PAA途徑完成底物的礦化。

圖9 菌株分解代謝PENG的代謝途徑Figure 9 The metabolic pathway of PENG in the catabolism of the strain.

β-內(nèi)酰胺酶是一種廣譜的水解酶，能催化各種不同的β-內(nèi)酰胺抗生素的水解。目前報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶分為A-D 4類。A類、C類和D類屬于絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，它們的活性位點(diǎn)均有絲氨酸，需要利用絲氨酸進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類藥物的水解[43]。B類屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶，一般需要利用二價(jià)鋅離子進(jìn)行藥物的水解[43]。本研究鑒定的PgkA經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析屬于A類β-內(nèi)酰胺酶，與已完成功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶的一致性最高為47.39%。這些A類β-內(nèi)酰胺酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為3個(gè)主要的分支，而PgkA獨(dú)立組成一個(gè)分支，這說(shuō)明菌株P(guān)G-8中的PgkA可能具有其獨(dú)特的進(jìn)化起源。通過(guò)比較酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)，PgkA對(duì)PGK的親和力與巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis)[44]、小麥蒼白桿菌(Ochrobactrum tritici)[45]和蔗糖小浴氏菌(Kosakonia sacchari)[46]中的β-內(nèi)酰胺酶類似。PgkB雖然也能催化PGK生成青霉噻唑酸，但其底物親和力只有PgkA的1/5，催化效率相較PgkA也很低。此外，PgkB與PgkA屬于完全不同的蛋白家族，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示PgkB屬于氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族，目前尚未見(jiàn)該家族中的酶催化PGK降解的報(bào)道。這些都說(shuō)明PgkB催化青霉素G降解的機(jī)制可能與PgkA完全不同。

分別敲除pgkA和pgkB后的PG-8突變株無(wú)論是底物降解還是細(xì)菌生長(zhǎng)速率都比野生株明顯減弱，說(shuō)明它們?cè)隗w內(nèi)都參與了青霉素G的分解代謝。PG-8-ΔpgkA不能將PGK完全降解，說(shuō)明pgkA在PGK降解過(guò)程中起著主導(dǎo)作用，這也與酶學(xué)分析結(jié)果相互驗(yàn)證。將pgkAB同時(shí)敲除后的突變株P(guān)G-8-ΔpgkAB仍能降解PGK，且與PG-8-ΔpgkA的底物降解速率差不多，但PG-8-ΔpgkAB卻喪失了利用PGK為唯一碳源生長(zhǎng)的能力。因此，本研究推測(cè)在菌株P(guān)G-8中可能還存在其他的酶能起始PENG的降解，由于酶活力不夠而達(dá)不到足夠的解毒作用，或者其催化的產(chǎn)物不能被進(jìn)一步降解，所以才導(dǎo)致PG-8-ΔpgkAB雖然能夠降解底物，但不能利用其為唯一碳源生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究從青霉素菌渣中獲得代爾夫特菌屬中第一株能高效降解PENG并利用其為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，命名為PG-8 (CCTCC M 2024394)。該菌株在pH為7.0、溫度為35 ℃、底物濃度為10.00 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出最佳的PGK降解和細(xì)菌生長(zhǎng)效果。結(jié)合組學(xué)分析、中間代謝產(chǎn)物、酶學(xué)和遺傳學(xué)鑒定推測(cè)了菌株P(guān)G-8分解代謝底物的代謝途徑。PgkA能催化PGK快速降解生成青霉噻唑酸，而且系統(tǒng)發(fā)育分析暗示該酶與已完成功能鑒定的其他β-內(nèi)酰胺酶具有不同的進(jìn)化起源。雖然PgkB也能催化PGK降解，但其底物親和力和催化效率顯著低于PgkA?；蚯贸突匮a(bǔ)說(shuō)明pgkA和pgkB都參與了菌株起始PENG的降解，但pgkA起主要作用。本研究不僅從分子、生化和遺傳學(xué)層面系統(tǒng)闡述了細(xì)菌降解青霉素G的分子機(jī)制，也對(duì)實(shí)現(xiàn)青霉素菌渣廢棄物的修復(fù)利用具有重要意義。

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