發(fā)酵補(bǔ)料

精細(xì)控制補(bǔ)料，是實(shí)現(xiàn)氨基酸高效發(fā)酵的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

在氨基酸發(fā)酵過(guò)程中，補(bǔ)料策略是連接優(yōu)良菌種和高效產(chǎn)出的橋梁，其核心在于通過(guò)動(dòng)態(tài)營(yíng)養(yǎng)供給，使菌體始終處于“最佳狀態(tài)”。

通過(guò)精細(xì)控制補(bǔ)料，能將尾碳濃度維持在適宜的低水平，有效避免分解代謝物阻遏，減少有害副產(chǎn)物生成，提高原料利用率和產(chǎn)品得率。

那么，氨基酸發(fā)酵過(guò)程中有哪些補(bǔ)料方式，不同的補(bǔ)料方式又需要注意哪些要點(diǎn)呢？

01 補(bǔ)料方式：兩種主流策略

選擇何種方式將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加到發(fā)酵罐中，直接影響著發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性。當(dāng)前主流的補(bǔ)料方式主要有以下兩種：

1. 分批補(bǔ)料（脈沖補(bǔ)料）

這種方式是將需要補(bǔ)充的物料在特定時(shí)間點(diǎn)，分批、脈沖式地加入發(fā)酵罐。其優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但缺點(diǎn)也很明顯：補(bǔ)料后，發(fā)酵罐內(nèi)的底物濃度會(huì)突然升高，隨后隨著菌體的消耗逐漸降低，容易造成底物濃度的周期性波動(dòng)。

這種波動(dòng)可能對(duì)菌體的均一生長(zhǎng)和穩(wěn)定代謝產(chǎn)生不利影響，尤其在對(duì)過(guò)程控制要求較高的發(fā)酵中，其局限性更加突出。

2. 連續(xù)補(bǔ)料

連續(xù)補(bǔ)料是指通過(guò)自動(dòng)化控制系統(tǒng)，以相對(duì)恒定的速率持續(xù)向發(fā)酵罐內(nèi)流加新鮮培養(yǎng)基。這種方式最大的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)l(fā)酵液中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物（如葡萄糖）濃度維持在一個(gè)狹窄且穩(wěn)定的理想范圍內(nèi)。

這為菌體營(yíng)造了一個(gè)近乎恒定的生長(zhǎng)環(huán)境，能有效避免底物抑制，顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。因此，連續(xù)補(bǔ)料已成為目前工業(yè)上高產(chǎn)量發(fā)酵的首選方式。

研究表明，在L-谷氨酸發(fā)酵中，采用連續(xù)補(bǔ)料方式相比分批補(bǔ)料，能顯著提高產(chǎn)量。

02 補(bǔ)料種類(lèi)：五大關(guān)鍵物質(zhì)

在氨基酸發(fā)酵中，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物和菌種特性，需要補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)各不相同。主要的補(bǔ)料種類(lèi)包括：

1. 碳源補(bǔ)料

葡萄糖、蔗糖等糖類(lèi)是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成最主要的能源和碳骨架來(lái)源。但初始碳源濃度過(guò)高可能抑制菌體生長(zhǎng)或產(chǎn)生大量副產(chǎn)物。

因此，通過(guò)流加方式將糖濃度維持在較低水平是常見(jiàn)策略。例如在L-丙氨酸發(fā)酵中維持在6-8 g/L，而在色氨酸發(fā)酵中甚至需維持在更低的0.01-0.2 g/L。

2. 氮源補(bǔ)料

氮元素是合成氨基酸的必備元素。銨鹽、尿素、氨水等是常用的氮源。其中，氨水較為特殊，它既能作為氮源，又能中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸，起到調(diào)節(jié)pH的雙重作用，因此在氨基酸發(fā)酵中應(yīng)用非常廣泛。

3. 微量元素補(bǔ)料

鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鋅（Zn）等微量元素雖然是微量的，但它們是許多關(guān)鍵酶輔酶的組成部分，對(duì)菌體代謝至關(guān)重要。

在發(fā)酵中后期流加微量元素，可以避免初期高濃度抑制，并補(bǔ)充后期的消耗。有專(zhuān)利技術(shù)提及將微量元素配制成混合液并進(jìn)行補(bǔ)料，以避免初期高濃度抑制和后期營(yíng)養(yǎng)不足。

4. 前體或誘導(dǎo)劑補(bǔ)料

在某些特定氨基酸的發(fā)酵中，添加特定的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)劑，可以顯著促進(jìn)目標(biāo)氨基酸的合成或誘導(dǎo)關(guān)鍵代謝途徑的高效表達(dá)。例如，在L-纈氨酸的發(fā)酵工藝中，通過(guò)在發(fā)酵中期流加玉米漿等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)纈氨酸的生物合成并減少副產(chǎn)物的生成。

5. 特殊生長(zhǎng)因子補(bǔ)料

有些氨基酸發(fā)酵菌種是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，需要額外添加生長(zhǎng)因子，如生物素、維生素等。例如，谷氨酸發(fā)酵菌種通常需要生物素作為生長(zhǎng)因子，其用量會(huì)影響細(xì)胞膜的透性，進(jìn)而影響谷氨酸的分泌。

下表概括了這些主要補(bǔ)料種類(lèi)及其功能：

03 控制要點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)補(bǔ)料的三個(gè)關(guān)鍵

制定了補(bǔ)料策略后，精準(zhǔn)的執(zhí)行是成功的關(guān)鍵。以下幾點(diǎn)需要特別關(guān)注：

1. 把握補(bǔ)料時(shí)機(jī)

開(kāi)始補(bǔ)料的時(shí)間點(diǎn)至關(guān)重要。對(duì)于生長(zhǎng)耦聯(lián)型發(fā)酵（菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成同步），通常在菌體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期、底物消耗到一定濃度時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料。

例如，在L-丙氨酸發(fā)酵中，當(dāng)初始糖濃度降至10 g/L左右時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖。

對(duì)于非生長(zhǎng)耦聯(lián)型發(fā)酵（產(chǎn)物合成在菌體生長(zhǎng)基本停止后），則多在菌體生長(zhǎng)基本結(jié)束、進(jìn)入產(chǎn)物合成期后開(kāi)始集中補(bǔ)料。

例如，在色氨酸發(fā)酵中，當(dāng)比氧消耗速率從高峰下降至5.0 mmol/h/g時(shí)，通過(guò)補(bǔ)加復(fù)合氮料控制代謝方向。

2. 精準(zhǔn)控制速率與協(xié)同效應(yīng)

補(bǔ)料的核心是控制補(bǔ)加速率，使其與菌體的消耗速率相匹配，維持動(dòng)態(tài)平衡。例如，在L-丙氨酸的發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)糖濃度，動(dòng)態(tài)調(diào)整補(bǔ)糖速率：當(dāng)糖含量≥8g/L時(shí)減少流加速率；當(dāng)糖含量≤6g/L時(shí)加大流加速率，以維持預(yù)設(shè)的濃度范圍。

此外，當(dāng)同時(shí)補(bǔ)加多種物料時(shí)，需要注意它們之間的配比協(xié)同，例如維持適宜的碳氮比（C/N） 對(duì)氨基酸的高效合成至關(guān)重要。在賴(lài)氨酸發(fā)酵中，可能需要同時(shí)流加葡萄糖液（碳源）、液氨和硫酸銨溶液（氮源），這就需要根據(jù)各自的消耗情況控制流速，維持適宜的碳氮比，以利于賴(lài)氨酸的合成。

3. 與其他參數(shù)聯(lián)動(dòng)控制

補(bǔ)料控制還需與pH、溶解氧等參數(shù)協(xié)同控制。例如，在L-丙氨酸發(fā)酵中，補(bǔ)糖策略與pH調(diào)節(jié)緊密關(guān)聯(lián)：糖濃度高時(shí)（≥8g/L）將pH控制在6.95-7.00之間；糖濃度低時(shí)（≤6g/L）將pH控制在6.80-6.85之間。這種動(dòng)態(tài)調(diào)控確保了菌體代謝環(huán)境的穩(wěn)定。

同樣重要的是溶解氧的控制。補(bǔ)加碳源會(huì)增加耗氧，需相應(yīng)提高攪拌轉(zhuǎn)速或通氣量以維持充足溶氧，防止因缺氧而轉(zhuǎn)產(chǎn)副產(chǎn)物。在色氨酸發(fā)酵中，采用攪拌聯(lián)動(dòng)，控制溶氧不低于20%。

4. 確保無(wú)菌操作

補(bǔ)料操作是發(fā)酵過(guò)程中一個(gè)重要的染菌風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)。無(wú)論是間歇補(bǔ)料還是連續(xù)補(bǔ)料，都必須確保補(bǔ)料管路和物料經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理，防止雜菌或噬菌體侵入發(fā)酵系統(tǒng)，導(dǎo)致整批發(fā)酵的失敗。

04 實(shí)踐案例：L-丙氨酸的補(bǔ)料控制

一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)展示了如何將上述原則整合應(yīng)用到L-丙氨酸發(fā)酵中：

• ? 微量元素混合液補(bǔ)加：在接種前便開(kāi)始以恒定速率（110-170 mL/min）流加，確保了整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)微量元素的穩(wěn)定供應(yīng)。
• ? 葡萄糖的流加：與在線糖度監(jiān)測(cè)聯(lián)動(dòng)，當(dāng)殘?zhí)墙抵?0 g/L時(shí)啟動(dòng)流加，并通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)速率將糖濃度精確維持在6-8 g/L的狹窄范圍內(nèi)。
• ? pH的協(xié)同控制：通過(guò)氨水流加控制，且pH設(shè)定值與糖濃度關(guān)聯(lián)（糖濃度高時(shí)pH略高，糖濃度低時(shí)pH略低），實(shí)現(xiàn)了碳源補(bǔ)充與pH調(diào)節(jié)的協(xié)同控制。
• ? 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的把握：在發(fā)酵后期（OD值達(dá)到30時(shí)），通過(guò)降低pH至6.5左右來(lái)誘導(dǎo)L-丙氨酸合成酶系的高效表達(dá)。

這一系列精細(xì)控制最終使得L-丙氨酸的產(chǎn)量達(dá)到152 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率在95.5%以上，體現(xiàn)了精細(xì)補(bǔ)料控制的強(qiáng)大效果。

結(jié)語(yǔ)

氨基酸發(fā)酵的補(bǔ)料控制是一門(mén)在動(dòng)態(tài)中尋求平衡的藝術(shù)。其核心原則可總結(jié)為：“看菌投料，動(dòng)態(tài)平衡”。