RNA提取及注意事項(xiàng)

目的

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)，需要從組織或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫(kù)構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1. Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。

2. RNase污染的主要來(lái)源是操作過(guò)程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)。

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會(huì)降低最后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見(jiàn)顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)最好在低溫下操作，防止在操作過(guò)程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特別結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時(shí)加入無(wú)RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

預(yù)備工作

RNA酶（Rnase）是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可暫時(shí)失活，但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時(shí)必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無(wú)菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)，通常不必再處理。

處理的步驟如下：

O在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

O將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過(guò)夜。

O 將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過(guò)的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

O 滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

（2）玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時(shí)以上。

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