手把手教你設(shè)計(jì) siRNA
自 1998 年 Fire 和 Mello 首次提出 RNAi(RNA interference，RNA 干擾) 概念以來，越來越多的人開始重視小 RNA 的研究，之后 RNAi 在基因功能的研究中也得到廣泛應(yīng)用。RNAi 是一種存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，在生物進(jìn)化過程中能夠抵御病毒感染及防止基因組中由于逆轉(zhuǎn)座子元件擴(kuò)增引起的不穩(wěn)定。
在 miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA) 等小 RNA 的介導(dǎo)下，RNAi 能夠特異性地調(diào)控 mRNA 基因在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。
小干擾 RNA(Small interfering RNA;siRNA) 與靶向特異性的 mRNA 結(jié)合，通過 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合體 RISC(RNA-induce siliencing complex) 介導(dǎo) mRNA 的降解。siRNA 長(zhǎng)度一般為 21 - 23nt，被 RISC 識(shí)別結(jié)合之后，siRNA 發(fā)生解旋。RISC 在 siRNA 的反義鏈指導(dǎo)下，尋找具有同源序列的內(nèi)源性的 mRNA，并在距離 5』端 10 - 11 位堿基之間切割 mRNA，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
siRNA 設(shè)計(jì)原則
RNAi 最終要通過 siRNA 片段與靶基因結(jié)合并使之降解，因此，確保高度同源于靶基因而絕無(wú)與其他基因同源的 siRNA 序列，是決定 RNAi 特異性的關(guān)鍵所在，也是 siRNA 設(shè)計(jì)的基本原則。從具有不同沉默效率的 siRNA 序列中篩選出高效的 siRNA 序列，需要經(jīng)過嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和不斷的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。下面我們就來看下 siRNA 設(shè)計(jì)要遵循哪些原則：
1.siRNA 序列在靶基因中的位置
從靶基因起始密碼子 AUG 下游 50～100 個(gè)核苷酸開始搜尋理想的 siRNA 序列，越靠近靶基因的 3′端，其基因沉默效果可能越好。
2. siRNA 序列的起始?jí)A基與長(zhǎng)度
SiRNA 序列最好為 AA(N n)UU(N 代表任意堿基;n 為堿基數(shù)目，在 19～29 nt 之間)， NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。最新研究表明 ，27 nt 或 29 nt 的 siRNA 與 21 nt siRNA 相比 27 nt SiRNA 對(duì)靶基因的最大抑制率可在相對(duì)低的濃度下得到。
3 .siRNA 3′端突出堿基的選擇
建議用 dTdT 取代 3′端的 2 個(gè)堿基突出，增強(qiáng) siRNA 雙鏈復(fù)合體的穩(wěn)定性。
4 .siRNA 序列中 G/ C 含量的選擇
G/C 含量在 30%～52% 的 siRNA 序列，其沉默基因效果較好。
5 .siRNA 中應(yīng)避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列
因?yàn)檫B續(xù) 2 個(gè)以上的 G 和 C 可以降低雙鏈 RNA 的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制 RNAi 作用；連續(xù) 3 個(gè)以上的 U 和 A 可能終止由 RNA Polymerase III 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。siRNA 序列中的重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在可以降低 siRNA 的有效濃度和沉默效率。
6 .siRNA 雙鏈的內(nèi)在穩(wěn)定性
反義鏈 5端的第一個(gè)堿基盡量為 A 或 U;siRNA 正義鏈的 5端第一個(gè)堿基盡量為 G 或 C。
7. siRNA 正義鏈的堿基偏愛性
正義鏈的第一位和第十九位堿基為 A; 正義鏈的第十位堿基為 U; 正義鏈的第十三位堿基不為 G; 正義鏈的第十九位堿基不為 G 或 C 時(shí)，siRNA 序列具有較高的基因沉默效率。
8 .siRNA 序列的特異性
目前沒有發(fā)現(xiàn) siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關(guān)系，為確保對(duì)靶 mRNA 的有效抑制，針對(duì)每一個(gè)靶基因結(jié)合上述 siRNA 設(shè)計(jì)原則選擇靶點(diǎn)相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。
siRNA 設(shè)計(jì)步驟
首先在 NCBI 上找到靶基因的目的片段，如果靶基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本就需要把所有 NM 號(hào)所對(duì)應(yīng)的 CDS 序列放在 clone Manager 中比對(duì)，并選擇擁有序列 CCDS 進(jìn)行設(shè)計(jì)。
目前沒有發(fā)現(xiàn) siRNA 的干擾效率與 mRNA 中具體位置的關(guān)系，為確保對(duì)靶 mRNA 的有效抑制，針對(duì)每一個(gè)靶基因結(jié)合上述 siRNA 設(shè)計(jì)原則選擇靶點(diǎn)相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 條序列。隨后將 siRNA 片段進(jìn)行 Blast 分析，盡量選擇與靶基因特異結(jié)合的序列，進(jìn)行化學(xué)合成后，通過實(shí)驗(yàn)篩選出沉默效率最高的 siRNA 序列進(jìn)行下一步的基因功能研究。
PS: 需要注意的是，有的 siRNA 序列在設(shè)計(jì)時(shí)沒有遵守這些指導(dǎo)方針，實(shí)驗(yàn)證明也具有很高的干擾效應(yīng)，這表明，我們只能根據(jù)上述指導(dǎo)方針設(shè)計(jì)出理論上具有較高沉默效應(yīng)的 siRNA 序列，siRNA 的最終活性需要用實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證 。
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