微生物學(xué)通報】潘國輝團(tuán)隊 | 放線菌素X2新產(chǎn)生菌株及其產(chǎn)量優(yōu)化

放線菌素(actinomycins)是一類主要由鏈霉菌(Streptomyces sp.)產(chǎn)生的色素肽內(nèi)酯類抗生素，具有顯著的抗腫瘤活性[1]。其基本結(jié)構(gòu)特征是2個五肽內(nèi)酯(pentapeptide lactone, PPL)通過酰胺鍵連接到1個共同的發(fā)色團(tuán)母核——吩噁嗪酮(2-氨基-4,6-二甲基吩嗯嗪-3-氧-1,9-二羧酸)上。大多數(shù)放線菌素的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)相同，并且均含有2個五肽環(huán)，但由于五肽環(huán)上氨基酸組成及排列順序的差異，形成了結(jié)構(gòu)多樣的放線菌素類化合物，如放線菌素D (MW: 1255.438)[2]、放線菌素X2 (MW: 1269.421)[3]、放線菌素Y9 (MW: 1255.394)[4]等(圖1)。

放線菌素通過嵌入DNA的小溝(特別是G+C富集區(qū))，抑制RNA聚合酶II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)p53依賴性的細(xì)胞凋亡，并通過G1期細(xì)胞周期阻滯，選擇性殺傷高增殖活性的腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[5]。目前，已從鏈霉菌中分離出20多種放線菌素類化合物，其中放線菌素D因其顯著的抗菌和抗腫瘤活性被廣泛研究，特別是在治療嬰兒腎母細(xì)胞瘤、兒童橫紋肌肉瘤及其他幾種惡性腫瘤中發(fā)揮了重要作用，并已在臨床上作為抗癌藥物使用[6]。

相較于放線菌素D，放線菌素X2的脯氨酸側(cè)鏈四氫吡咯環(huán)經(jīng)過羰基修飾(圖1)，這一微小的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致二者在生物學(xué)功能上存在差異。研究表明，放線菌素X2對人類肝癌細(xì)胞系[如hepatocellular carcinoma G2 (HepG2)[7]]、人類白血病細(xì)胞株(如HL-60細(xì)胞)[8]、乳腺癌細(xì)胞系(如MCF-7、MDA-MB-231等)具有更高的細(xì)胞毒性[9]。此外，放線菌素X2在抗結(jié)核、抗菌、抗羅氏肉瘤病毒感染等方面也展現(xiàn)出良好的活性[3,10-12]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，放線菌素X2同樣展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用潛力。例如，放線菌素X2對柑橘潰瘍病的致病菌——地毯草黃單胞桿菌(Xanthomonas citri subsp. citri)具有顯著的抑菌活性，其防治效果優(yōu)于市售農(nóng)藥[Cu2(OH)3Cl]，并且對于幼苗和蚯蚓沒有毒性，表明其有望開發(fā)為新型抗柑橘潰瘍病菌藥劑[13]。此外，放線菌素X2可用于絲綢織物的染色，展現(xiàn)出優(yōu)異的染色性能、抗菌性能及紫外線防護(hù)能力，并且具有良好的生物安全性[14]，為其在紡織領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的方向。

自1940年首次從土壤來源的抗生放線菌(Actinomyces antibioticus)中發(fā)現(xiàn)了放線菌素以來[2]，多個放線菌素產(chǎn)生菌相繼被發(fā)現(xiàn)，如鏈霉菌屬的抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus) ZS[15]、黃灰鏈霉菌(Streptomyces flavogriseus) NJ-4[16]、哥斯達(dá)黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus) SCSIO ZS0073[17]，以及戈登氏菌(Gordonia sp.) WA-31[12]和葡萄球菌(Staphylococcus sp.) VITURAJ10[18]等。然而，大多數(shù)菌株可產(chǎn)生多種放線菌素類化合物，并且以放線菌素D為主，而主要產(chǎn)生放線菌素X2的菌株較為稀少，目前僅報道了Streptomyces sp. MITKK-103[8]、Streptomyces sp. JAU4323[19]等少數(shù)幾株。在放線菌素X2產(chǎn)量提升研究中，除篩選高產(chǎn)菌株外，培養(yǎng)基優(yōu)化也是有效策略。例如，研究表明，利用響應(yīng)面法優(yōu)化Streptomyces sp. JAU4234的發(fā)酵培養(yǎng)基，可顯著提高其放線菌素X2產(chǎn)量[20]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基因工程已成為提高微生物天然產(chǎn)物產(chǎn)量的重要策略[21]。例如，可通過強(qiáng)啟動子高表達(dá)關(guān)鍵生物合成酶和輔助蛋白、增強(qiáng)正調(diào)控蛋白表達(dá)、抑制負(fù)調(diào)控蛋白表達(dá)，以及優(yōu)化底物和輔因子供應(yīng)，從而有效提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率。然而，迄今未見文獻(xiàn)報道利用基因工程方法提高放線菌素X2產(chǎn)量的研究。

本研究旨在通過生物信息學(xué)分析和代謝產(chǎn)物表征相結(jié)合的策略，挑選并鑒定以放線菌素X2為主要產(chǎn)物的新產(chǎn)生菌。進(jìn)一步結(jié)合基因工程手段，即過表達(dá)關(guān)鍵生物合成酶、輔助蛋白及正調(diào)控蛋白，以期提高放線菌素X2的產(chǎn)量，從而為未來設(shè)計和構(gòu)建更優(yōu)的放線菌素X2高產(chǎn)菌株提供新的元件、途徑、菌株和理論基礎(chǔ)，以推動放線菌素X2的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)研究。

圖1  代表性放線菌素類天然產(chǎn)物

Figure 1  Representative actinomycin natural products.

2.1  菌株JCM 4594中放線菌素生物合成基因簇分析及信息完善

本課題組此前已對具備基因組數(shù)據(jù)的鏈霉菌(從NCBI和JGI數(shù)據(jù)庫獲取)進(jìn)行了系統(tǒng)性的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇分析[33]。其中，從菌株JCM 4594的基因組序列(RefSeq: GCF_014650355.1)中鑒定出與放線菌素生物合成前體相關(guān)的酶編碼基因，以及部分非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPS)編碼基因，并將這一基因區(qū)域命名為acx基因簇。相較于已知放線菌素D產(chǎn)生菌S. costaricanus SCSIO ZS0073[17]中的生物合成基因簇(acn)，其同源蛋白相似度為81%–93%。并且在基因簇中還發(fā)現(xiàn)了一個ferredoxin (acxS)基因，而acn基因簇中并沒有。Ferredoxin作為電子載體，能夠為AcxP (P450)提供電子，從而高效催化氧化反應(yīng)。Ferredoxin的存在表明JCM 4594具有產(chǎn)生放線菌素X2的潛力，提示JCM 4594可能是一株新的放線菌素X2生產(chǎn)菌。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，JCM 4594的放線菌素生物合成基因簇并不完整，尤其是與放線菌素D的生物合成基因簇acn相比，關(guān)鍵的NRPS的編碼基因存在缺失。為了進(jìn)一步解析該基因簇，通過與已知的放線菌素生物合成基因簇進(jìn)行比對，初步確定了斷裂片段的連接順序，并通過PCR測序驗證，成功將JCM 4594的放線菌素生物合成基因簇補充完整(圖2)。并將補充序列acxN2–N3上傳至CNCB，登記號為C_AA104971.1[34]。隨后將基因簇acx與acn進(jìn)行全面比對，結(jié)果顯示，acx基因簇中與acn基因簇里的同源基因相似度為78%–94%。

采用MLSA方法計算了菌株JCM 4594與已知放線菌素產(chǎn)生菌之間的基因組相似度，以確認(rèn)其是否為新的放線菌素產(chǎn)生菌?；蚪M序列比較結(jié)果顯示，菌株JCM 4594與Streptomyces sp. MBT27[35]聚成一個分支，其Kimura雙參數(shù)距離為0.003 14，低于區(qū)分同一物種的閾值0.007。已有的關(guān)于鏈霉菌屬MLSA的研究通常認(rèn)為0.007是區(qū)分是否為同一物種的Kimura雙參數(shù)距離閾值[26]。因此數(shù)據(jù)分析表明，菌株JCM 4594和菌株MBT27屬于鏈霉菌屬中的同一物種黃色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces xanthochromogenes)。通過antiSMASH分析對比兩者的基因簇，發(fā)現(xiàn)這2個菌株的基因簇并不完全一致，其中菌株JCM 4594中含有hesrlactone基因簇，而菌株MBT27中并未發(fā)現(xiàn)該基因簇，表明菌株JCM 4594和MBT27是不同的菌株。這些結(jié)果表明，菌株JCM 4594是一株潛在的放線菌素X2產(chǎn)生新菌株。

圖2  黃色產(chǎn)色鏈霉菌JCM 4594生物信息學(xué)分析   A：黃色產(chǎn)色鏈霉菌JCM 4594放線菌素X2基因簇(acx)與哥斯達(dá)黎加鏈霉菌SCSIO ZS0073放線菌素D基因簇(acn)對比；B：菌株JCM 4594及其他放線菌素產(chǎn)生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析(自舉支持率: 0–1)。

Figure 2  Bioinformatics analysis of Streptomyces xanthochromogenes JCM 4594. A: Comparison of the actinomycin X2 gene cluster (acx) of strain JCM 4594 with the actinomycin D gene cluster (acn) of S. costaricanus SCSIO ZS0073; B: Phylogenetic analysis of strain JCM 4594 and other actinomycin-producing strains (bootstrap range; 0–1).

2.2  菌株JCM 4594是新的放線菌素X2產(chǎn)生菌

根據(jù)文獻(xiàn)[20]報道，MSC種子培養(yǎng)基和MSCP發(fā)酵培養(yǎng)基有助于放線菌素X2的產(chǎn)生。此外，又選取了2個常用于鏈霉菌代謝產(chǎn)物發(fā)酵分析的培養(yǎng)體系進(jìn)行實驗，最終選用3種培養(yǎng)體系(TSB-SSM、TSB-SPM1、MSC-MSCP)對菌株JCM 4594進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以確定該菌株是否能夠產(chǎn)生放線菌素X2。HPLC分析結(jié)果顯示，在3種培養(yǎng)體系中均可檢測到在440 nm處具有特征紫外吸收的化合物，支持其為放線菌素X2 (圖3A)。其中，使用MSC-MSCP培養(yǎng)體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，產(chǎn)物量最高。接下來，進(jìn)行了JCM 4594的擴(kuò)大發(fā)酵(2 L)，并通過C18柱層析、Sephadex LH20柱層析、制備HPLC等方法從中純化得到化合物1，根據(jù)高分辨電噴霧電離質(zhì)譜(high-resolution electrospray ionization mass spectrometry, HRESIMS) [M+H]+ 1 269.614 4 (圖3B)推測的分子式為C62H84N12O17。進(jìn)一步，依據(jù)1H/13C NMR數(shù)據(jù)(表3)，觀察到特征發(fā)色團(tuán)吩噁嗪酮的信號，分別為H-8 (δ 7.51, d, J=7.8 Hz)、H-9 (δ 7.45 d, J=8.2 Hz)、4-Me (δ 2.04, s)和7-Me (δ 2.57, s)。此外，與放線菌素D結(jié)構(gòu)不同，放線菌素X2結(jié)構(gòu)中β五肽環(huán)上的脯氨酸側(cè)鏈吡咯環(huán)的C4亞甲基被氧化成羰基(δ 210.1)，這一特征也被觀察到。最后，將這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]中的信息進(jìn)行比對，確認(rèn)化合物1為放線菌素X2。

除了放線菌素X2，通過紫外吸收光譜和高分辨質(zhì)譜分析，從發(fā)酵產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了放線菌素類似物，HRESIMS顯示[M+H]+ 1 255.608 3 (calc. 1 255.599 9) (圖3C)，預(yù)測的分子式為C61H82N12O17?；谝陨辖Y(jié)果，推測化合物2為已知化合物放線菌素Y9[4]。這些實驗結(jié)果表明菌株JCM 4594是新的放線菌素產(chǎn)生菌株，主要產(chǎn)物為放線菌素X2。

已有研究表明，放線菌素X2對多種腫瘤細(xì)胞系具有顯著毒性，例如在人源肝癌細(xì)胞系HepG2中，其IC50值可達(dá)0.12 nmol/L[7]。由于HepG2和人肝細(xì)胞癌7 (human hepatocellular carcinoma-7, HuH-7)在分化程度、增殖能力等生物學(xué)特性上存在差異，而HuH-7也是研究肝癌常用的細(xì)胞系[36]，所以本研究進(jìn)一步對HuH-7進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，以補充和完善放線菌素X2的抗腫瘤活性數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，放線菌素X2對HuH-7細(xì)胞系表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，IC50值為6.8 nmol/L。同時，還評估了放線菌素X2對于人宮頸癌細(xì)胞系HeLa的抑制活性，IC50值為4.4 nmol/L，與文獻(xiàn)[37]報道的對宮頸癌細(xì)胞的抑制活性水平相當(dāng)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明放線菌素X2在抗腫瘤領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值。

圖3  黃色產(chǎn)色鏈霉菌JCM 4594代謝產(chǎn)物分析   A：菌株JCM 4594在不同培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物分析；B：放線菌素X2的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)；C：放線菌素Y9的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

Figure 3  Metabolite analysis of Streptomyces xanthochromogenesJCM 4594. A: Metabolite analysis of strain JCM 4594 under different cultivation conditions; B: High-resolution mass spectrometry data of actinomycin X2; C: High-resolution mass spectrometry data of actinomycin Y9.

表3  放線菌素X2在CD3OD中的1H NMR (500 MHz)和13C NMR (125 MHz)數(shù)據(jù)

Table 3  1H NMR (500 MHz) and 13C NMR (125 MHz) data of actinomycin X2 in CD3OD

2.3  菌株JCM 4594中放線菌素X2生物合成途徑預(yù)測分析

基于生物信息學(xué)分析，并參考已有關(guān)于放線菌素D和放線菌素X2生物合成途徑的研究文獻(xiàn)[17,38-39]，推測出菌株JCM 4594中放線菌素X2的生物合成途徑(圖4)。與已知的放線菌素D基因簇acn對比分析[17]，結(jié)果表明，acx基因簇包含放線菌素X2合成所需的關(guān)鍵基因，包括前體2-氨基-3-羥基4-甲基苯甲酸(4-methyl-3-hydroxyanthranilic acid, 4-MHA)合成基因(acxH, acxG, acxM, acxL)、肽鏈合成的NRPS基因(acxE, acxN1, acxN2, acxN3)和后修飾基因(acxP, acxF)。此外，acx基因簇還包含編碼ferredoxin的基因acxS，推測其為P450氧化酶AcxP提供電子，AcxP催化的氧化反應(yīng)是放線菌素X2與放線菌素D在化學(xué)結(jié)構(gòu)上差異的關(guān)鍵原因。具體而言，AcxH (色氨酸2,3-雙加氧酶)催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸，隨后由AcxG、AcxM和AcxL催化生成4-MHA[17]。該前體被AcxN1識別、腺苷化并與載體蛋白AcxE連接。接著，由2個NRPSs (AcxN2, AcxN3)將l-蘇氨酸、d-纈氨酸、l-脯氨酸、l-肌氨酸和l-N-甲基丙氨酸進(jìn)行縮合，并釋放形成PPL。推測AcxP在AcxS和一個未知ferredoxin還原酶的協(xié)同作用下，催化連接在module 5上的多肽鏈中l(wèi)-脯氨酸4位亞甲基的氧化，形成酮基，隨后在TE功能域作用下釋放形成O-PPL[39]。最后，AcxF催化PPL和O-PPL二聚化形成最終產(chǎn)物放線菌素X2 (圖4)[17]。此外，推測AcxN3中模塊3的A結(jié)構(gòu)域可識別5-甲基脯氨酸，而模塊5的A結(jié)構(gòu)域可識別l-丙氨酸，這可能是JCM 4594還產(chǎn)生微量放線菌素Y9的原因(圖4)。

圖4  黃色產(chǎn)色鏈霉菌JCM 4594中放線菌素X2和Y9的推測生物合成途徑

Figure 4  Putative biosynthetic pathway of actinomycins X2 and Y9 in Streptomycesxanthochromogenes JCM 4594.

2.4  菌株JCM 4594中放線菌素X2的產(chǎn)量優(yōu)化

上述分析表明，AcxN1、AcxN2和AcxN3是合成放線菌素X2母核結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶。此外，基因簇中存在一個特殊基因acxD，其編碼的蛋白AcxD屬于霉菌素生物合成基因簇蛋白H (mycobactin biosynthetic gene cluster protein H, MbtH)類蛋白。MbtH類蛋白是一類分子量較小(約10 kDa)的蛋白，能夠非共價地與NRPS中的腺苷酸化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)NRPS的折疊，提高其穩(wěn)定性和活性[40-42]。有研究表明，過表達(dá)MbtH類蛋白有助于提高非核糖體肽類天然產(chǎn)物的產(chǎn)量[43]。此外，該基因簇還編碼林可霉素生物合成基因簇蛋白U (lincomycin biosynthetic gene cluster protein H, LmbU)類蛋白AcxO。LmbU類蛋白通常作為正調(diào)控因子，調(diào)控生物合成基因簇的表達(dá)。已有研究表明，過表達(dá)該類調(diào)控因子可以顯著提高放線菌素D、林可霉素等天然產(chǎn)物的產(chǎn)量[15,44-45]。

基于上述分析，在菌株JCM 4594野生型中分別過表達(dá)acxO和acxD，以及在acxN1和acxN2之間引入雙向強(qiáng)啟動子kasOp*-SF14，以實現(xiàn)acxN1和acxN2N3 (根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測，acxN2和acxN3共轉(zhuǎn)錄)的高表達(dá)，從而提高放線菌素X2的產(chǎn)量。通過將構(gòu)建的質(zhì)粒pSET152-kasOp*-acxO和pSET152-kasOp*-acxD分別轉(zhuǎn)入野生型中，獲得了acxO高表達(dá)重組菌株WT-acxO和acxD高表達(dá)重組菌株WT-acxD。同時，將質(zhì)粒pKC1139-ST-kasOp*-SF14轉(zhuǎn)入野生型，通過同源重組將雙向啟動子kasOp*-SF14插入acxN1和acxN2之間，從而獲得重組菌株WT::kasOp*-SF14。

基于HPLC分析，繪制了在440 nm波長下峰面積與放線菌素X2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5A)，用于放線菌素X2的定量研究。隨后，對WT、WT-acxO、WT-acxD和WT::kasOp*-SF14進(jìn)行了平行發(fā)酵，并通過HPLC分析放線菌素X2的產(chǎn)量。結(jié)果顯示，WT菌株的放線菌素X2產(chǎn)量約為1.8 mg/L。相較于WT，采用強(qiáng)啟動子促進(jìn)核心生物合成基因acxN1和acxN2N3高表達(dá)的重組菌株WT::kasOp*-SF14，其放線菌素X2產(chǎn)量提升約7倍，達(dá)到12.6 mg/L。過表達(dá)acxO的菌株WT-acxO，其放線菌素X2產(chǎn)量提高約21.5倍，達(dá)到38.7 mg/L；而過表達(dá)acxD的菌株WT-acxD，其放線菌素X2產(chǎn)量提高約23.8倍，達(dá)到42.8 mg/L (圖5B)。這些結(jié)果表明，所采用的基因工程策略均顯著提高了放線菌素X2的產(chǎn)量。

圖5  基因工程策略提升放線菌素X2的產(chǎn)量   A：放線菌素X2的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：WT及相關(guān)過表達(dá)重組菌株的放線菌素X2產(chǎn)量分析。

Figure 5  Enhancement of actinomycin X2 production through genetic engineering strategies. A: Standard curve of actinomycin X2; B: Analysis of actinomycin X2 production in WT and related overexpression recombinant strains.

放線菌素X2不僅具有良好的抗菌和抗癌活性[46]，還表現(xiàn)出染色特性[14]，并對柑橘潰瘍病具有預(yù)防和治療作用[13]，在醫(yī)藥、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用潛力。盡管已發(fā)現(xiàn)多種放線菌素生產(chǎn)菌株，但以放線菌素X2為主要代謝產(chǎn)物的菌株仍然較為稀少。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)菌株JCM 4594含有可合成放線菌素類化合物的基因簇acx，并將其與已知的S. costaricanus SCSIO ZS0073[17]放線菌素D生物合成基因簇(acn)進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，acx與acn編碼的同源蛋白相似度為78%–94%。另外，acx基因簇比acn額外包含一個編碼鐵氧還蛋白(ferredoxin)的基因acxS，其是P450酶AcxP催化氧化反應(yīng)過程中電子傳遞系統(tǒng)的重要組成部分，這是菌株JCM 4594主要產(chǎn)生放線菌素X2的關(guān)鍵因素之一。通過培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵產(chǎn)物分離純化、HRESIMS和NMR技術(shù)，我們證實菌株JCM 4594主要產(chǎn)生放線菌素X2，并少量生成放線菌素Y9。這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了以放線菌素X2為主要產(chǎn)物的菌株資源，也為相關(guān)研究提供了新的菌種材料。

放線菌素X2具有重要的應(yīng)用價值，因此提高其產(chǎn)量具有顯著的研究意義。已有研究通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提升放線菌素X2的產(chǎn)量[20]。然而，在微生物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提升的研究中，基因工程改造策略已成為最重要的手段之一[22]。但是至今尚無利用基因工程方法提升放線菌素X2產(chǎn)量的研究報道。本研究通過原位強(qiáng)啟動子插入以提升關(guān)鍵NRPS編碼基因的表達(dá)強(qiáng)度，過表達(dá)正調(diào)控因子和相關(guān)輔助蛋白量，成功實現(xiàn)了放線菌素X2產(chǎn)量的不同程度提升，最高達(dá)42.8 mg/L，提升倍數(shù)為23.8倍。研究結(jié)果表明，基因工程策略能夠從多個角度有效提高放線菌素X2的產(chǎn)量。在后續(xù)的研究中，將嘗試整合這些有效策略，進(jìn)一步推動放線菌素X2產(chǎn)量的提升。

本研究發(fā)現(xiàn)并證實了菌株JCM 4594是一株以放線菌素X2為主要產(chǎn)物的新的產(chǎn)生菌，并成功鑒定了放線菌素X2的生物合成基因簇，并通過多種基因工程改造手段顯著提高了其產(chǎn)量。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)了放線菌素X2對HuH-7的強(qiáng)抑制活性。本研究為未來設(shè)計和構(gòu)建高產(chǎn)放線菌素X2菌株提供了新的基因元件、生產(chǎn)菌株及理論基礎(chǔ)，將進(jìn)一步推動放線菌素X2的應(yīng)用開發(fā)研究。