微生物學(xué)通報(bào)】基于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鹵醇脫鹵酶高效表達(dá)及應(yīng)用
目的鹵醇脫鹵酶作為一種生物催化劑，兼具閉環(huán)與開(kāi)環(huán)反應(yīng)活性，在手性環(huán)氧化合物等合成領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其綠色高效制備具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC編碼序列N端進(jìn)行基于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)HheC的高效表達(dá)，并將其應(yīng)用于手性環(huán)氧氯丙烷的合成。
方法采用mRNA預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)，以降低mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、提高折疊自由能(ΔG)為目標(biāo)，在不改變氨基酸序列的前提下設(shè)計(jì)高表達(dá)5′mRNA序列，并表征酶的表達(dá)效率和催化性能。
結(jié)果基于5′mRNA序列設(shè)計(jì)獲得了HheC突變體，其蛋白表達(dá)水平從16.71%提升至33.39%，對(duì)1,3-二氯-2-丙醇的相對(duì)酶活提高了3倍。
結(jié)論基于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化可顯著提高HheC表達(dá)水平，提升目標(biāo)產(chǎn)物合成效率，為構(gòu)建酶法催化合成手性環(huán)氧氯丙烷路線奠定了基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)
1.3 重組菌株構(gòu)建
表1 5′mRNA突變引物序列Table 1 Mutant primers of 5′mRNA sequences
a：下游通用引物。
a: Downstream universal primer.
1.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與分析
1.5 鹵醇脫鹵酶催化1,3-DCP合成手性環(huán)氧氯丙烷
2 結(jié)果與分析
2.1 5′mRNA序列設(shè)計(jì)
表2 5′mRNA序列設(shè)計(jì)Table 2 Design of synonymous mutation sequences of 5′mRNA
a：下劃線代表起始密碼；b：源于ViennaRNA；c：源于Mfold。
a: The underline represents the start codon; b: Calculated by ViennaRNA; c: Calculated by Mfold.
