高毒力肺炎克雷伯菌實(shí)驗(yàn)室檢測-1

hvKP是肺炎克雷伯菌的高毒力變種，具有高侵襲性和高致病性的特點(diǎn)，較經(jīng)典肺炎克雷伯菌（cKP）更容易引發(fā)嚴(yán)重的侵襲性和播散性感染，如肝膿腫、膿毒血癥等。本篇內(nèi)容根據(jù)《高毒力肺炎克雷伯菌實(shí)驗(yàn)室檢測專家共識(shí)》整理。

一、鏡下及培養(yǎng)

臨床標(biāo)本直接涂片、革蘭染色鏡檢，鏡下可見革蘭陰性桿菌，可見明顯莢膜。

培養(yǎng)：血瓊脂平板上可見大、黏稠、易融合成片的菌落；麥康凱上為粉紅色黏稠的菌落。hvKP可為有拉絲的菌落。

二、hvKP鑒定

1. 生化表型鑒定：hvKP與cKP生化表型鑒定幾無差別。

2. hvKP確認(rèn)：當(dāng)前臨床常用于檢測hvKP和評(píng)估毒力的方法包括表型和基因檢測。本篇僅學(xué)習(xí)表型檢測，下一篇內(nèi)容學(xué)習(xí)基因檢測。

hvKP生物學(xué)活性（毒力）確認(rèn)包括：拉絲試驗(yàn)、莢膜分型、鐵載體檢測和毒力表型檢測。

拉絲試驗(yàn)：

使用接種環(huán)豎直向上輕輕蘸起血瓊脂平板上的單個(gè)菌落，菌落拉絲長度≥5 mm為拉絲試驗(yàn)陽性，提示具備高黏液表型。提示：需要注意的是，研究發(fā)現(xiàn)高毒力和中毒力菌株之間黏度表型并無顯著性差異，說明拉絲試驗(yàn)并不能作為檢測hvKP和評(píng)估毒力強(qiáng)弱的靈敏方法及確診的指標(biāo)，僅可作為hvKP的生物學(xué)特征之一。

莢膜分型：

（1）免疫學(xué)方法：基于莢膜K抗原的傳統(tǒng)血清學(xué)分型應(yīng)用最為廣泛，但血清交叉反應(yīng)會(huì)對(duì)結(jié)果判斷有一定影響。莢膜血清型在hvKP的生物學(xué)鑒定中有一定的參考價(jià)值，一些莢膜血清型（如K1、K2、K5、K20和K54等）在hvKP中占很大的比例。

（2）分子生物學(xué)方法：wzi分型，采用PCR技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出大量莢膜結(jié)構(gòu)相關(guān)基因片段，擴(kuò)增出莢膜聚合酶基因wzi，測序后上傳序列至數(shù)據(jù)庫（https：//bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl？db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=query）進(jìn)行比對(duì)，得到菌株K型，這是一種快速簡便的篩查方法。

鐵載體檢測：鐵載體是鑒別cKP和hvKP的重要指標(biāo)。

檢測方法：（1）定性分析：制備含有鉻天青S染料的檢測培養(yǎng)基，37 ℃下過夜孵育后，菌落周圍形成不透明的金黃色區(qū)域，表明產(chǎn)生了高水平的鐵載體。（2）定量分析：制備不同濃度鐵載體的標(biāo)準(zhǔn)品和鐵載體分析液，反應(yīng)混合物培養(yǎng)30 min后在630 nm處測量OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算鐵載體含量，濃度報(bào)告單位為g/L，≥0.03 g/L能較強(qiáng)烈預(yù)測為hvKP。

毒力表型檢測：

（1）中性粒細(xì)胞殺菌活性試驗(yàn)：以中性粒細(xì)胞與細(xì)菌共孵育后（殺菌試驗(yàn)后）細(xì)菌存活率表示hvKP菌株的毒力強(qiáng)弱，細(xì)菌存活率=［加中性粒細(xì)胞共孵育的實(shí)驗(yàn)組的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）/不加中性粒細(xì)胞共孵育的對(duì)照組CFU］×100%。

（2）血清抗性實(shí)驗(yàn)：將細(xì)菌與正常人血清（normal human serum，NHS）混合，37 ℃培養(yǎng)3 h。細(xì)菌存活率=（使用血清細(xì)菌懸液CFU/無NHS的細(xì)菌懸液CFU）×100%。