從樣品制備到結(jié)果分析，磷酸化蛋白WB全流程

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心機(jī)制，其研究對解析生命奧秘與疾病機(jī)理至關(guān)重要。但 Western Blot 檢測磷酸化蛋白，卻因目標(biāo)蛋白低豐度、易降解、動態(tài)變化的特性，成為科研界公認(rèn)的 “噩夢級操作”—— 條帶弱、無條帶、高背景、雜帶多等問題頻發(fā)，任何環(huán)節(jié)的微小失誤都可能讓實(shí)驗(yàn)前功盡棄。想要攻克這一難題，從樣品制備到結(jié)果分析的全流程精細(xì)化優(yōu)化必不可少。

樣品制備：筑牢檢測根基，從源頭規(guī)避失效風(fēng)險(xiǎn)

磷酸化蛋白檢測的核心痛點(diǎn)集中在低豐度與易去磷酸化，而樣品質(zhì)量直接決定實(shí)驗(yàn)成敗，新鮮度與處理規(guī)范性是不可妥協(xié)的前提。樣品制備需堅(jiān)守快、冷、準(zhǔn)三大核心原則，三者缺一不可。

快是指細(xì)胞裂解時(shí)需迅速加入預(yù)冷的裂解液，且裂解液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，其中蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑缺一不可 —— 前者抑制蛋白降解，后者阻斷磷酸基團(tuán)脫落，若檢測酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，還需額外添加 1μM 正礬酸鈉強(qiáng)化保護(hù)。冷則要求所有試劑、耗材提前 4℃預(yù)冷，離心機(jī)調(diào)至 4℃，全程冰上操作，組織樣品研磨需用液氮預(yù)冷研缽，細(xì)胞樣品超聲破碎也需在冰浴中進(jìn)行，35-40% 功率下 3 次破碎，每次 1-2 秒、間隔 5-10 秒，避免溫度升高導(dǎo)致修飾丟失。準(zhǔn)體現(xiàn)在刺激條件的精準(zhǔn)把控，不同靶點(diǎn)的藥物濃度、處理時(shí)間差異顯著，需通過文獻(xiàn)查閱或預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，刺激不足會導(dǎo)致信號微弱，過度刺激則可能觸發(fā)負(fù)反饋機(jī)制，反而降低檢測效率，如 10ng/mL EGF 處理 Hela 細(xì)胞，10-20 分鐘為最佳刺激窗口，超過 30 分鐘則幾乎檢測不到條帶。

此外，實(shí)驗(yàn)前需通過 UniProtKB、Phospho SitePlus 等數(shù)據(jù)庫，明確目標(biāo)蛋白的磷酸化位點(diǎn)與表達(dá)水平，為抗體選擇與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。樣品濃度測定后，加入上樣緩沖液分裝凍存于 - 80℃，避免反復(fù)凍融造成磷酸基團(tuán)降解。

抗體選擇：特異性為核心，靈敏度是關(guān)鍵

抗體的選擇直接決定檢測結(jié)果的可靠性，特異性不足或靈敏度不夠，后續(xù)操作再規(guī)范也難以挽回。磷酸化抗體與非磷酸化抗體的識別特性存在本質(zhì)差異：非磷酸化抗體可能交叉識別磷酸化與非磷酸化蛋白，部分則僅識別非磷酸化形式；而磷酸化抗體的核心價(jià)值在于僅識別磷酸化蛋白，其位點(diǎn)特異性是檢測精準(zhǔn)度的核心保障。

選擇磷酸化抗體時(shí)，需先通過文獻(xiàn)確認(rèn)目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，優(yōu)先選擇針對特異位點(diǎn)的抗體。同時(shí)必須仔細(xì)研讀說明書，不同生產(chǎn)商的抗體在操作要求上可能存在差異，盲目照搬通用流程易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。以 Phospho-EGFR（Tyr1068）抗體為例，經(jīng) 10ng/mL EGF 處理 30 分鐘的血清饑餓 Hela 細(xì)胞，能呈現(xiàn)清晰條帶，未處理細(xì)胞則無特異性信號，這正是位點(diǎn)特異性的直接體現(xiàn)。

考慮到磷酸化蛋白僅占總蛋白的 1%-10%，部分場景下占比更低，高靈敏度抗體成為弱信號檢測的關(guān)鍵?？贵w稀釋倍數(shù)需謹(jǐn)慎優(yōu)化，同一抗體在 1:2000、1:20000、1:200000 的稀釋比例下，條帶清晰度差異顯著，過高稀釋會導(dǎo)致信號丟失，過低則可能增加背景干擾，需結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)比例。

內(nèi)參設(shè)置：雙保險(xiǎn)加持，精準(zhǔn)校準(zhǔn)磷酸化水平

磷酸化蛋白 WB 的內(nèi)參設(shè)置絕非可有可無，單一內(nèi)參難以排除實(shí)驗(yàn)干擾，雙內(nèi)參體系才能實(shí)現(xiàn)磷酸化水平的精準(zhǔn)評估。

第一重保險(xiǎn)是目標(biāo)蛋白對應(yīng)的總蛋白。檢測磷酸化蛋白時(shí)，必須同步檢測其總蛋白，只有當(dāng)磷酸化蛋白與總蛋白的比值發(fā)生變化，才能確鑿證明磷酸化水平的改變。這一設(shè)置能有效排除轉(zhuǎn)錄水平波動、蛋白質(zhì)合成與降解差異等非磷酸化相關(guān)因素的干擾，精準(zhǔn)定位磷酸化修飾在特定生理過程中的作用。

第二重保險(xiǎn)是常規(guī)內(nèi)參抗體，如 GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 等。這類內(nèi)參的核心作用是對實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)，排查上樣量不均、轉(zhuǎn)膜效率差異等操作層面的誤差，確保結(jié)果的可靠性。以 Phospho-HER2（Tyr1221,1222）抗體檢測為例，經(jīng) 200ng/mL EGF 處理 10 分鐘的細(xì)胞呈現(xiàn)清晰條帶，未處理組無信號，雙內(nèi)參的同步檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果的真實(shí)性。

實(shí)驗(yàn)操作：細(xì)節(jié)決定靈敏度，規(guī)范流程少踩坑

樣品與抗體的準(zhǔn)備到位后，實(shí)驗(yàn)操作的細(xì)節(jié)把控直接影響信號質(zhì)量，每一步都需嚴(yán)格遵循磷酸化蛋白的檢測特性。

封閉環(huán)節(jié)需摒棄脫脂奶粉，優(yōu)先選擇 5% BSA 封閉液。脫脂奶粉中含有的酪氨酸可能與磷酸化抗體非特異性結(jié)合，直接導(dǎo)致高背景問題。封閉時(shí)間以 1 小時(shí)為宜，過長會掩蓋抗原表位，造成信號丟失，過短則封閉不充分，同樣引發(fā)背景干擾。

轉(zhuǎn)膜推薦采用濕轉(zhuǎn)法，恒流 250mA 條件下轉(zhuǎn)膜 90 分鐘，確保磷酸化蛋白完全轉(zhuǎn)移至膜上。膜的選擇優(yōu)先 PVDF 膜，使用前需用甲醇激活 10 秒，增強(qiáng)蛋白結(jié)合能力。轉(zhuǎn)膜時(shí)的 “三明治” 組裝需按濾紙 - 膠 - 膜 - 濾紙的順序進(jìn)行，全程避免氣泡殘留，否則會導(dǎo)致局部信號缺失。

抗體孵育需摒棄 “速戰(zhàn)速決” 的思路，磷酸化抗體建議 4℃孵育過夜，12-16 小時(shí)的充足時(shí)間能保證抗體與抗原充分結(jié)合，且低溫環(huán)境可維持蛋白在膜上的穩(wěn)定性，避免脫落。二抗則在室溫下孵育 1 小時(shí)，搖床保持 60rpm 低速，防止背景彌散。

洗脫步驟需平衡信號保留與背景去除，建議用 PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘，搖床轉(zhuǎn)速逐步從 80rpm 提升至 120rpm。適度保留微弱背景信號遠(yuǎn)比過度洗滌導(dǎo)致的 “白板” 更有價(jià)值，為后續(xù)結(jié)果分析預(yù)留空間。

結(jié)果分析：精準(zhǔn)排查異常，進(jìn)階技術(shù)放大信號

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，面對異常結(jié)果無需盲目重復(fù)，精準(zhǔn)定位問題根源并針對性解決，才能高效推進(jìn)研究。

條帶弱或無條帶是最常見的問題，核心原因多為抑制劑失效或樣品刺激不充分。解決思路是確保抑制劑現(xiàn)用現(xiàn)配，重新優(yōu)化刺激條件，或選用說明書推薦的陽性對照樣品，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性。高背景、雜帶多則大概率與封閉液選擇不當(dāng)相關(guān)，更換 5% BSA 或無蛋白封閉液可有效改善。條帶彌散多由蛋白降解導(dǎo)致，需提高裂解液中蛋白酶抑制劑濃度，強(qiáng)化全程低溫操作。膜污染多因操作不當(dāng)，全程使用無塵手套，用鈍頭鑷子夾取膜可避免此類問題。

為進(jìn)一步提升檢測效果，可采用進(jìn)階技術(shù)放大信號。IP-WB 聯(lián)用通過免疫沉淀對目標(biāo)蛋白進(jìn)行濃縮，能有效富集低豐度磷酸化蛋白，顯著提高檢測靈敏度。熒光 WB 尤其是雙色檢測法，可同時(shí)孵育 Cy3 標(biāo)記的磷酸化蛋白抗體與 Cy5 標(biāo)記的總蛋白抗體，實(shí)現(xiàn)同步檢測，結(jié)果更精準(zhǔn)。此外，用 TBST 替代 PBS 作為緩沖液，可減少非特異性條帶，若中間步驟使用了 PBS，需在加入檢測底物前用大量 TBST 清洗，去除過量磷酸鈉。