流式數(shù)據(jù)分析，去粘連了嗎？

流式細(xì)胞術(shù)作為科研中廣泛應(yīng)用的單細(xì)胞分析技術(shù)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性直接決定實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可信度。但不少研究者在數(shù)據(jù)分析時(shí)，往往會(huì)忽略一個(gè)關(guān)鍵干擾因素 —— 細(xì)胞粘連體。這些由多個(gè)細(xì)胞粘附形成的異常結(jié)構(gòu)，不僅會(huì)導(dǎo)致信號(hào)測(cè)量失真，還可能堵塞儀器、延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，成為實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的 “隱形殺手”。做好粘連體的識(shí)別與排除，是流式數(shù)據(jù)分析的必備步驟，更是科研數(shù)據(jù)嚴(yán)謹(jǐn)性的基本保障。

粘連體：流式分析的 “隱形干擾源”

粘連體又稱(chēng)多聚體或黏連體，是檢測(cè)過(guò)程中兩個(gè)及以上細(xì)胞因物理或化學(xué)作用粘附形成的結(jié)構(gòu)。其危害遠(yuǎn)不止信號(hào)異常這么簡(jiǎn)單：較大的粘連體會(huì)堵塞檢測(cè)系統(tǒng)，導(dǎo)致液流不穩(wěn)定，進(jìn)而減慢樣本獲取速度、延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間；更關(guān)鍵的是，它會(huì)破壞單細(xì)胞分析的核心前提，使細(xì)胞計(jì)數(shù)、表型分析、周期檢測(cè)等結(jié)果出現(xiàn)偏差，甚至直接誤導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)論的方向。在注重?cái)?shù)據(jù)可靠性的科研場(chǎng)景中，粘連體的存在相當(dāng)于給實(shí)驗(yàn)結(jié)果埋下了一顆 “定時(shí)炸彈”。

粘連體的形成：這些誘因不可忽視

粘連體的產(chǎn)生并非偶然，而是與樣本處理、檢測(cè)條件等多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。細(xì)胞濃度過(guò)高或過(guò)度離心會(huì)造成機(jī)械性聚集；細(xì)胞死亡后裂解釋放的粘稠 DNA，會(huì)顯著增加細(xì)胞間粘附的概率；不當(dāng)?shù)臉颖颈４娣绞?，如溫度超過(guò) 45℃，會(huì)提升樣本黏度進(jìn)而促進(jìn)粘連；此外，體系中存在的促進(jìn)粘連陽(yáng)離子、樣品通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)的速度過(guò)快，以及儀器液流異常等，都可能誘發(fā)或加重這一現(xiàn)象。把控好這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是減少粘連體產(chǎn)生的基礎(chǔ)防線。

信號(hào)原理：辨別粘連體的核心依據(jù)

流式信號(hào)的本質(zhì)是細(xì)胞通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)時(shí)產(chǎn)生的脈沖信號(hào)，其特征由三個(gè)核心參數(shù)定義：高度對(duì)應(yīng)最大光信號(hào)強(qiáng)度，寬度代表細(xì)胞與激光的相互作用時(shí)間，面積則是脈沖持續(xù)時(shí)間內(nèi)的積分，反映細(xì)胞總體光信號(hào)強(qiáng)度。單細(xì)胞通過(guò)激光區(qū)時(shí)，這三個(gè)參數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定的對(duì)應(yīng)關(guān)系；而當(dāng)細(xì)胞粘連形成復(fù)合體時(shí)，脈沖高度與單細(xì)胞差異不大，但由于通過(guò)激光區(qū)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，脈沖寬度增加，進(jìn)而導(dǎo)致脈沖面積顯著上升。這種信號(hào)特征的差異，正是識(shí)別粘連體的核心原理。

常規(guī)去除策略：散射光脈沖信號(hào)的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)的光信號(hào)包含前向散射光和側(cè)向散射光，二者通常采用線性刻度記錄，是排除粘連體的常用工具。實(shí)際操作中，研究者多選擇前向散射光或側(cè)向散射光的任意兩個(gè)脈沖參數(shù)進(jìn)行組合分析，通過(guò)篩選符合單細(xì)胞信號(hào)特征的群體，實(shí)現(xiàn)粘連體的初步去除。但這一方法存在明顯局限 —— 當(dāng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、樣本制備存在異質(zhì)性，或細(xì)胞大小差異顯著時(shí)，容易出現(xiàn)誤判。例如在 DNA 含量檢測(cè)的細(xì)胞周期分析中，大細(xì)胞可能因散射光面積值較高，被錯(cuò)誤歸類(lèi)為粘連體，影響分析結(jié)果。

精準(zhǔn)解決方案：DNA 熒光脈沖的優(yōu)勢(shì)場(chǎng)景

針對(duì)常規(guī)散射光法的局限，DNA 染料測(cè)量通道提供了更可靠的選擇。該通道采用線性刻度，能精準(zhǔn)反映細(xì)胞的 DNA 含量，而粘連體的 DNA 總量顯著高于單細(xì)胞，其脈沖信號(hào)特征的差異更為明確。在腫瘤細(xì)胞系等異質(zhì)性較強(qiáng)的樣本分析中，這一方法的優(yōu)勢(shì)尤為突出。以 A549 細(xì)胞周期分析為例，結(jié)合 DNA 熒光脈沖信號(hào)與周期蛋白 B1 的表達(dá)分析，可有效鑒別 G0/G1 期粘連體。周期蛋白 B1 僅在 G2+M 期表達(dá)，缺乏該蛋白免疫熒光且 DNA 熒光信號(hào)符合粘連體特征的細(xì)胞，可被精準(zhǔn)篩選排除，大幅提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。

樣品處理：影響去粘連效果的關(guān)鍵變量

不同的樣品處理方式，會(huì)直接影響粘連體的去除效率。研究對(duì)比了三種常見(jiàn)處理方法：裂解洗滌不固定、裂解不洗滌固定以及無(wú)裂解無(wú)洗滌。結(jié)果顯示，無(wú)裂解無(wú)洗滌處理時(shí)，紅細(xì)胞與白細(xì)胞易同時(shí)通過(guò)激光束，導(dǎo)致前向散射光高度與面積參數(shù)難以區(qū)分單細(xì)胞；而裂解處理后的樣本，可通過(guò)光散射雙脈沖信號(hào)有效篩選單細(xì)胞。值得注意的是，無(wú)論樣品是否經(jīng)過(guò)裂解或固定，基于 DNA 熒光脈沖信號(hào)的方法均能穩(wěn)定排除粘連體，展現(xiàn)出更強(qiáng)的通用性。這一特性在高濃度樣本或稀有細(xì)胞檢測(cè)中尤為重要 —— 這類(lèi)場(chǎng)景中散射光法難以區(qū)分單細(xì)胞，而 DNA 熒光法可精準(zhǔn)鑒別粘連體，同時(shí)捕獲更多真實(shí)單細(xì)胞信號(hào)。

流式數(shù)據(jù)分析的核心是 “真實(shí)反映單細(xì)胞狀態(tài)”，而粘連體的存在會(huì)直接打破這一前提。從減少誘因的樣本制備，到基于信號(hào)特征的精準(zhǔn)鑒別，再到結(jié)合樣品類(lèi)型的方法選擇，去粘連是一個(gè)貫穿實(shí)驗(yàn)全程的系統(tǒng)工程。研究者需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型、樣本異質(zhì)性、檢測(cè)目的等因素，靈活選擇合適的去粘連策略：常規(guī)樣本可采用散射光法，異質(zhì)性強(qiáng)或周期分析樣本優(yōu)先選擇 DNA 熒光法，高濃度或特殊處理樣本需結(jié)合多種方法驗(yàn)證。唯有重視并做好粘連體的排除工作，才能確保流式數(shù)據(jù)的可靠性，為科研結(jié)論提供堅(jiān)實(shí)支撐，避免因 “隱形干擾” 導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)資源浪費(fèi)與結(jié)論偏差。